Rôle de l'Importin alpha dans la formation de l'enveloppe nucléaire in vitro

The role of the adaptor molecule Importin α in nuclear envelope assembly in vitro

• Auteur / Autrice : Virginie Hachet
• Direction : Iain W Mattaj
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Biologie moléculaire de la cellule
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Paris 11 en cotutelle avec European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European molecular biology laboratory (Heidelberg, Allemagne)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne)

Mots clés

Mots clés libres

Phosphorylation

Protéines NLS

Membranes

GTPAse

Résumé

Chez les eucaryotes, le noyau, contenant l'information génétique est délimité par l'enveloppe nucléaire. Au cours du cycle cellulaire, l'enveloppe nucléaire se désintègre puis se reforme autour des chromosomes. Les mécanismes responsables de la reformation de l'enveloppe nucléaire peuvent être étudiés en utilisant des extraits d'œufs de Xénope. Nous avons étudié le rôle de l'Importine alpha, molécule impliquée dans l'import de protéines contenant un signal de localisation nucléaire (NLS), dans ce processus. L'addition en excès de cette protéine ou de son substrat BSA-NLS inhibe la formation d'une enveloppe nucléaire autour de la chromatine. Ces résultats suggèrent un rôle de l'Importine alpha dans ce processus. De plus, le retrait de la protéine endogène des extraits d'œufs de Xénope inhibe l'assemblage de l'enveloppe nucléaire. Trop ou trop peu d'Importin alpha dans le système inhibe la reformation de l'enveloppe nucléaire in vitro. L'équilibre entre la quantité d'Importine alpha et de ses substrats NLS semble crucial pour ce processus. Nous avons démontré que l'Importine alpha pouvait s'associer aux membranes et que cette association était régulée par phosphorylation. L'Importine alpha cytosolique est plus phosphorylée que l'Importine alpha liée aux membranes. La phosphorylation de l'Importine alpha liée aux membranes induit la dissociation de celle-ci des membranes. L'utilisation de formes mutantes de l'Importine alpha qui soit ne lient pas les membranes, soit ne sont pas relarguées des membranes par phosphorylation, a permis de démontrer un rôle direct de la forme membranaire de l'Importine alpha dans la reformation de l'enveloppe nucléaire in vitro.

In eukaryotes, the nucleus, containing the genetic information, is delimited by the nuclear envelope (NE). During the cell cycle, the NE disassembles and then re-assembles around the chromosomes. The molecular mechanisms underlying NE formation can be studied using a nuclear assembly reconstitution assay based on Xenopus laevis egg extract. We analysed the role of Importin alpha, adaptor molecule involved in the import of NLS-containing proteins. Addition of excess Importin alpha or BSA-NLS substrate to a nuclear assembly reaction inhibits the formation of a NE around chromatin, suggesting a direct or indirect role for the protein in this process. Moreover, addition of affinity purified antibodies directed against Importin alpha or depletion of the endogenous protein from Xenopus egg cytosol inhibits NE formation. Thus, too much or too little Importin alpha negatively affects nuclear assembly in vitro. The balance of Importin apha and NLS proteins in the system is of critical importance. An unexpected finding of our study was that Importin alpha can associate with membranes and that this association is regulated by phosphorylation. We could show that cytosolic Importin alpha is highly phosphorylated as compared to membrane-bound Importin alpha. Phosphorylation of membrane-associated Importin alpha leads to its release from membranes. Phosphopeptide mapping and mutagenesis analysis allowed us to identify some of the phospho-residues within Importin alpha. Using mutant forms of Importin alpha that either do not bind membranes or are not released from them by phosphorylation, we provide evidence that membrane-bound Importin alpha functions in NE formation in vitro.