Production of recombinant chitin deacetylase for value addition in crustacean chitin waste

• Auteur / Autrice : Binesh Shrestha
• Direction : Jean-Marc Simonet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques. Microbiologie, biotechnolgie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chitosane

Chitine

Mots clés libres

Pichia pastoris

Colletotrichum lindemuthianum

Résumé

La chitine est produite en quantité importante dans la biosphère. Elle existe dans les squelettes externes des Arthropodes (crustacés et insectes) et dans la paroi des champignons. La forme deacétylée, appelée chitosan, est rare dans la nature. Cependant, il s'agit d'un produit très interessant pour la médicine, l'agriculture et pour plusieurs branches de l'industrie (pharmacie, cosmétique, traitement des eaux, microélectronique). La production mondiale actuelle de chitosan est très faible et peu rentable sur le plan commercial. Le chitosan du commerce est traditionellement produit par déacétylation chimique de la chitine des crustacés à haute température. Cette technologie produit du chitosan de mauvaise qualité. L'utilisation de grandes quantités d'alcalis concentrés provoque une dégradation du produit final et génère des déchets dangereux pour l'environnement. Un procédé alternatif, basé sur la déacétylation enzymatique de la chitine, pourrait être une alternative attrayante et éviterait les inconvénients de la méthode chimique. De nombreuses recherches sont menées dans ce sens au niveau international. Le clonage d'un gène codant une chitine-déacétylase dans un hôte bien adapté pourrait aboutir à une production rentable de chitine-déacétylase et donc de chitosan. Le gène codant la chitine déacétylase de Colletotrichum lindemuthianum UPS9 a été identifié, cloné et surexprimé chez Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum et Pichia pastoris. Seule P. Pastoris a permis la sécrétion d'une chitine déacétylase active. La production a été realisée en fermenteur. L'enzyme a été purifiée et caractérisée au niveau enzymatique grâce à la mise au poin d'une nouvelle méthode

Chitin is produced in enormous quantities in the biosphere. It exists in the outer skeleton of arthropods (crustaceans and insects) and in the cell wall of many fungi. The deacetylated form of chitin, chitosan, is rarely found in nature. Chitosan is an interesting fine chemical which has wide applications in various branches of industry (pharmaceutical, cosmetics, food, textile, water purification and microelectronics). Chitosan is commercially produced by thermochemical deacetylation of crustacean chitin waste using strong alkaline condition at high temperature. Chitosan obtained from this method is usually damaged by chemical degradation. Moreover release of large quantities of alkaline waste water are produced. An alternative method of deacetylation by an enzymatic method might overcome the drawbacks of the thermochemical method. Research on the enzymatic deacetylation carried out so far by other institutes has not resulted in a satisfactory process. The cloning of gene encoding chitin deacetylase, the expression in a suitable host and further engineering of enzyme may help in high level production of functional chitin deacetylase. The gene encoding the chitin deacetylase of Colletotrichum lindemuthianum has been identified and cloned in Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum and Pichia pastoris. P. Pastoris was found to be capable of expressing active chitin deacetylase in the extracellular medium. The production of chitin deacetylase was carried out in a fermenter. The enzyme was purified and characterized with the help of a new method of enzymatic assay developed in this study.