Microscopie non linéaire : chiralité et génération de second harmonique

• Auteur / Autrice : Thierry Boulesteix
• Direction : Marie-Claire Schanne-Klein
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Fluorescence à deux photons

Contraste endogène

Colorants chiraux

Résumé

En microscopie non linéaire, il est possible de réaliser de l'imagerie fonctionnelle tridimensionnelle de tissus épais vivants ou de cellule. Le contraste provient soit de colorants optimisés (contraste exogène), soit de protéines naturellement présentes dans les tissus (contraste endogène). Nous abordons la microscopie non linéaire de ces deux points de vue, essentiellement en SHG (génération de second harmonique) mais aussi en TPEF(fluorescence à 2 photons). Notre travail sur les colorants pour la microscopie SHG s'appuie sur l'étude optique non linéaire des mécanismes intervenant dans l'activité optique des molécules chirales. Cette chiralité doit permettre d'améliorer l'imagerie SHG membranaire quand les molécules s'organisent de façon centrosymétrique dans la membrane. Nous démontrons que la chiralité du colorant doit être par couplage excitonique. Nous étudions un prototype de ce type de colorant : l'ASTB (base de Troger disubstituée). Nous étudions et utilisons deux sources de contraste endogènes : le collagène (SHG) et l'élastine (TPEF). Après caractérisation des propriétés optiques non linéaires, nous montrons comment la microscopie combinée de TPEF et de SHG permet de réaliser une étude morphologique sur du tissu artériel épais vivant de Rat. Nous mettons alors en évidence les effets dramatiques du lindane (un insecticide) sur le système cardio-circulatoire. Nous réalisons la première étude nanotoxinologique en microscopie non linéaire à partir du signal de second harmonique des filaments de myosine. Nous mesurons une contracture au repos de cellules atriales de cœur de Grenouille soumises à une toxine (la saxitoxine), avec une précision de 20 nm.

Nonlinear microscopy enables functional 3D imaging of living thick tissues or cells. The cused in imaging may come from synthetic dyes (exogenous contrast) or from proteins in tissues(endogenous contrast). We perform nonlinear microscopy with both of these approaches. In particularly, we use SHG(Second Harmonic Generation) and TPEF (Two Photon Excited Fluorescence). Our work on dyes for SHG microscopy rests on non linear optical study of the mechanisms of optical activity in chiral molecules. The chirality should enhance SHG membrane's imagery when molecules are in centrosymmetric arrangement in membranes. We demonstrate that chirality of the dye must come from an excitonic coupling. We study such a colorant : the ASTB (Acridin Subsituted Troger Base). We study and use two sources of endogenous contrast : collagen (SHG) and elastin (TPEF). After characterisation of their nonlinear optical properties, we demonstrate that the combination of TPEF and SHG in microscopy enables a morphological study of fresh living arterial tissue in Rats. We also show the dramtic effects of lindane (an insecticide) on the vascular system. We perform the first nanotxinologic study in nonlinear microscopy based on SHG signals from myosin filaments. We measure a contracture of atrial frog cells with the introduction of a toxin (saxitoxin) with a resolution of 20 nm.