Etude protéomique des cellules endothéliales et identification de protéines impliquées dans leur apoptose induite par l'étoposide

Proteomic study of endothelial cells and identification of proteins involved in etoposide-induced apoptosis

• Auteur / Autrice : Arnaud Bruneel
• Direction : Bruno Baudin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie. Biochimie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Paris 5
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale du Médicament (....-2009Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université Paris Descartes. Faculté de pharmacie de Paris (....-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Électrophorèse bidimensionnelle

Apoptose

Étoposide

Dissertations universitaires comme sujet

Protéome

Cellules endothéliales

Résumé

L'électrophorèse bi-dimensionnelle (2D) permet aujourd'hui de séparer plusieurs centaines de protéines sur un gel avec un pouvoir de résolution pouvant atteindre quelques centièmes d'unité pH ; par ailleurs, les techniques de spectrométrie de masse MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization-time of flight) et ESI-MS/MS (electospray ionizationtandem mass spectrometry) fournissent des données de masse et/ou de séquencepeptidique permettant leur identification. Nous avons utilisé cette association analytique pour étudier le contenu protéique global, ou protéome, des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVECs) en primocultures. Ce modèle, bien qu'imparfaitement représentatif de l'endothélium humain in vivo, est très utilisé en recherche et a fortement contribué à l'avancée des connaissances concernant la physiopathologie vasculaire. Près d'un millier de protéines d'HUVECs ont été séparées entre les pH 3 et 10 ; parmi elles, 162, fortement exprimées à pH acide, ont été identifiées. L'étude fonctionnelle de ces identifications a permis, d'une part, de mieux caractériser les cellules endothéliales humaines et a, d'autre part, révélé certaines protéines spécifiques de l'endothélium comme l'endothélial protein disulfide isomérase (endoPDI). L'étude protéomique différentielle des HUVECs traitées par l'étoposide, un anticancéreux inducteur d'apoptose, a montré les modulations d'expression significatives de huit protéines : la cofiline, les GRPs 78 et 94 (glucose regulated proteins), la laminin receptor protein, la valosin containing protein, la protease inhibitor 9, l'apolipoprotéine A1 et la tropomyosine. Ces variations ont confirmé l'implication de la voie mitochondriale dans notre modèle d'apoptose et ont également suggéré celle du réticulum endoplasmique. Enfin, l'étude protéomique des effets du phorbol myristate acétate, un activateur de la protéine kinase C, a montré de nombreuses différences d'expression par rapport à l'état quiescent qui devraient permettre de mieux comprendre les voies biochimiques de la régulation de la protéine anti-apoptotique bcl-2 ainsi que de l'initiation du processus d'angiogenèse. En perspective, ces résultats suggèrent qu'il sera bientôt possible d'identifier des molécules protectrices pour l'endothélium vasculaire et donc bénéfiques pour les patients traités par les chimiothérapies anticancéreuses.

In this work, we have carried out the proteomic study of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) using the combination of 2D-electrophoresis, automated trypsin digestion, peptide mass fingerprinting analysis after MALDI-TOF MS and peptide sequencing using nano LC-ESI-MS/MS. The overall functional characterization of the 162 identified proteins from primary cultures of HUVECs confirms the metabolic capabilities of endothelium and illustrates various cellular functions more related to cell motility and angiogenesis, protein folding, anti-oxidant defenses, signal transduction, proteasome and resistance to apoptosis. In comparison with controls cells, the differential proteomic analysis of HUVECs treated by the pro-apoptotic topoisomerase inhibitor etoposide further revealed the modulation of eight proteins namely, GRP78, GRP94, valosin-containing protein, proteinase inhibitor 9, cofilin, 37 kDa laminin receptor protein, bovine apolipoprotein and tropomyosin. These data suggest that etoposide-induced apoptosis of human vascular endothelial cells results from the intricate involvement of multiple apoptosis processes including at least the mitochondrial and the endoplasmic reticulum stress pathways. The presented 2D pattern and protein database,as well as the data related to apoptosis of HUVECs, are available at http://www. Huvec. Com.