The pancreatic macrophage compartment in health and autoimmune diabetes : a study on maturation, mobility and matrix interactions

= Het macrofaag compartiment in de pancreas in gezondheid en autoimmune diabetes : een studie over maturatie, mobiliteit en matrix interacties

• Auteur / Autrice : Sacha Brigitte Geutskens
• Direction : Steven Willem Jan Lamberts
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Paris 5 en cotutelle avec Rotterdam universiteit

Mots clés

Mots clés contrôlés

Pancréas

Macrophages

Maladies métaboliques

Complications du diabète

Macrophages

Pancréas

Résumé

Type 1 diabetes is a disease that results from a disturbed glucose metabolism due to a deficiency in insulin production. This deficiency is the consequence of immune-mediated damage to the insulin-producing p-cells. The cause of type 1 diabetes is presently unknown and probably multifactorial. The initiation and progression of the inflammatory process that destroys the p-cells involves the interplay of environmental factors with an autoimmune-prone genetic background. Abnormal immune regulation explains the autoimmune phenomena observed in diabetic patients and in spontaneous animal models for the disease to a limited extent only. The precise reason for the immune system to target the pancreatic islets of Langerhans is still unclear. The pathogenic process in the pancreas is characterized by the pathology-related intra-islet infiltration of T and B-lymphocytes that mediate islet destruction. This T and B-celUnfiltration is preceded by an accumulation of macrophages and dendritic cells at the islet periphery. The early peri-islet accumulation of these antigen presenting cells probably reflects the first response of the immune system that is progressively heading for islet destruction. Macrophages are involved in every step of the diabetogenic process. In the non-obese diabetic (NOD) mouse that spontaneously develops diabetes, various macrophage-abnormalities like defective maturation, reduced phagocytosis and increased production of IL-12, have been described previously. Moreover, macrophages are present in higher numbers in the pancreas of the NOD mouse from birth onwards, randomly distributed in the connective tissue and exocrine parenchyma. In this thesis we present the results of our studies on the murine pancreatic macrophage compartment. We have questioned in particular the possible underlying causes for the abnormal early peri-islet accumulation of macrophages. Therefore, the studies were performed with an emphasis on the interactions of macrophages with the extracellular matrix of the pancreatic connective tissue. In our first study we show that the depletion of macrophages and dendritic cells from the endocrine pancreas was accompanied by a total disappearance of lymphocytes from the pancreas. Hence, pancreatic macrophages and dendritic cells are critically involved in the local progression of islet inflammation in NOD mice by mediating the retention and possibly the recruitment of lymphocytes to the pancreas. Importantly, this depletion significantly postponed the onset of diabetes, leading to a strongly decreased incidence by 35 weeks of age. In the second study described, we have phenotypically characterized the pancreatic macrophages. The majority of macrophages were characterized by the expression of MMGL and sialoadhesin. Only a minority of these pancreatic macrophages expressed the macrophage marker F4/80 under non-inflammatory conditions. By contrast, macrophages expressing F4/80 were observed massively before the onset of destructive insulitis in the NOD pancreas, and their presence is particularly associated with islet destruction. This suggests that F4/80 identifies a particular subset of inflammatory macrophages in the pancreas that are virtually absent under non- inflammatory conditions. Interestingly, in the fetal pancreas mature macrophages were exclusively identified by their expression of F4/80 and these macrophages lacked the expression of MMGL and sialoadhesin. In addition, we present data that support the conclusion that macrophages develop from pre-existing precursors that are present in the fetal pancreas at E12. 5. Using an in vitro approach, we demonstrated that their numbers significantly increased in fetal pancreas explants cultured with M-CSF. This increase of F4/80-positive cells was paralleled by an increase in the number of insulin-producing cells, suggesting that macrophages support insulin-cell growth in vitro. These results are in line with the results of the third study that is presented in this thesis. Early postnatal pancreases from NOD mice are characterized by an increase in the percentage of endocrine tissue and by enlarged and irregularly-shaped islets, concomitantly with the presence of increased numbers of macrophages. Importantly, the levels of the extracellular matrix protein fibronectin are significantly increased during this pre-weaning period as well. Fibronectin labeling was mostly localized at the islet-ductal pole, islet periphery and in intralobular septa. Interestingly, pancreatic macrophages mainly reside at sites with intense fibronectin-labeling. In a fourth study we demonstrate that, paradoxically, NOD macrophages exhibit impaired fibronectin-mediated adhesion and migration due to the defective expression of the integrin-type fibronectin receptor a-chain, CD49d. In addition, we show that extracellular-regulated kinase-1/2 (ERK-1/2) is a negative regulator of CD49d expression in macrophages. NOD macrophages were characterized by increased levels of the activated form of this kinase when stimulated with the toll-like receptor-4 (TLR-4) ligand, lipopolysaccharide (LPS). LPS-stimulation resulted in the impaired upregulation of CD49d levels in NOD macrophages as compared to macrophages of other mouse strains. We believe that this specific defect in the macrophage compartment of NOD mice might play a role in the observed peri-islet accumulation. At the end of this thesis, we have postulated the working hypothesis that the observed presence of higher levels of the endogenous TLR-4 ligand fibronectin in the NOD pancreas in combination with the inappropriate TLR-4-responsiveness of NOD macrophages contributes to their local retention and activation. This unfortunate activation may damage the neighboring islets, unintentionally provoking an immune response eventually leading to the development of autoimmunity. We have uncovered several abnormalities that may trigger a mechanism that possibly contributes to the development of spontaneous autoimmune diabetes in the NOD mouse. Whether similar abnormalities are present in type 1 diabetic patients remains to be established.

De pancreas, ook wel alvleesklier genoemd, is een in de buikholte gelegen orgaan met verschillende functies. Het grootste gedeelte van de pancreas bestaat uit exocrien weefsel dat verteringsenzymen uitscheidt in de dunne darm. Slechts iets meer dan één procent van de pancreas wordt gevormd door de eilandjes van Langerhans. Deze endocriene eilandjes produceren verschillende hormonen die worden uitgescheiden in het bloed. Het belangrijkste hormoon is insuline, gemaakt door de p-cellen die zijn gelegen in het midden van de eilandjes. Insuline verlaagt de glucose-spiegel en reguleert zo de opslag van energie uit ons voedsel. Patiënten met type 1 diabetes hebben een gevaarlijk hoge concentratie van glucose in het bloed door een tekort aan insuline. Dit tekort wordt veroorzaakt door de vernietiging van de p-cellen door het eigen afweersysteem en resulteert in een ernstige verstoring van het metabolisme. Deze immuunreactie tegen deze eiland-cellen ontstaat vaak al op heel jonge leeftijd en is onomkeerbaar. Patiënten met type 1 diabetes zijn daarom genoodzaakt hun verdere leven insuline te gebruiken. Er zijn verschillende afwijkingen gevonden in het immuunsysteem van type 1 diabetes patiënten, die gerelateerd zijn aan het onstaan van autoimmuniteit. Deze autoimmuniteit lijkt echter voornamelijk gericht te zijn tegen de endocriene eilandjes en daarom noemen we type 1 diabetes een orgaan-specifieke autoimmuunziekte. Waarom het immuunsysteem van type 1 diabetes-patiënten zich juist tegen de eigen p-cellen keert is niet duidelijk. Het kan zijn dat de oorzaak van de immuunrespons tegen de eilandjes in de pancreas zelf ligt. Om te bestuderen wat er in de pancreas plaatsvindt voordat de specifieke afweerreactie ontstaat, zijn we genoodzaakt onderzoek te doen in proefdieren. Niet-obese diabetische (NOD)-muizen ontwikkelen spontaan diabetes. Voorafgaand aan de specifieke immuunreactie tegen de p-cellen zien we in de pancreas van deze muizen veel niet-specifieke afweercellen rondom de eilandjes. Deze niet-specifieke immuuncellen worden macrofagen genoemd. Macrofagen zijn in alle organen aanwezig en vormen daar de eerste verdediging tegen pathogene indringers. Macrofagen ruimen bacteriën op en alarmeren andere cellen van het immuunsysteem om een afweerreactie tot stand te brengen. Deze afweerreactie moet specifiek gericht zijn tegen de pathogene indringers en niet tegen ons eigen weefsel. Dit laatste gebeurt helaas wel bij patiënten met type 1 diabetes. Er is echter onvoldoende bewijs dat de afweerreactie tegen de eilandjes samenhangt met een eerdere infectie. Omdat macrofagen mede onze afweerreactie aansturen, kunnen ze een heel belangrijke rol spelen in het ontstaan van autoimmuunziekte. In het onderzoek dat is beschreven in dit proefschrift, hebben we de macrofagen in de pancreas nader bestudeerd en onderzocht wat de oorzaak kan zijn van de vroege accumulatie van macrofagen rondom de eilandjes. We laten zien dat er verschillende typen macrofagen aanwezig zijn in de pancreas. In de volwassen muis bleek een bepaald type macrofaag specifiek geassocieerd met ontsteking en deze is in hoge mate aanwezig in de pancreas van de NOD muis. De pancreas macrofagen bevinden zich in het bindweefsel van de pancreas, tussen het exocriene weefsel maar ook rondom de eilandjes waar veel fibronectine aanwezig is. Fibronectine is een matrix eiwit wat enerzijds een rol speelt bij pancreas¬ontwikkeling en anderzijds bij de ontwikkeling en mobiliteit van macrofagen. In de pancreas van NOD muizen werden allereerst verhoogde concentraties fibronectine gevonden in de periode voorafgaand aan het ontstaan van de afweerreactie tegen de eilandjes. Verder laten wij zien dat de eilandjes in de pancreas van de NOD muis groter en grilliger van vorm zijn dan die in gezonde muizen. Deze afwijkingen kunnen samenhangen met het verhoogde aantal macrofagen dat in de NOD pancreas aanwezig is. In tegenstelling tot wat wij hadden verwacht, vertonen macrofagen van de NOD muis een verzwakte interactie met fibronectine. Ze hebben een verstoorde expressie van een van de eiwitten waarmee macrofagen aan fibronectine binden, het CD49d integrine. Dit leidt tot een defect in de beweeglijkheid van de NOD macrofagen over fibronectine en kan daardoor bijdragen aan de vroege accumulatie van de macrofagen rondom de eilandjes. De oorzaak van de defecte expressie van dit integrine ligt in een verstoorde aansturing van de expressie binnenin de cel. Deze verkeerde aansturing is ook betrokken bij de activatie van macrofagen door moleculen uit de bacteriewand. Stimulatie van de NOD macrofagen door deze moleculen of eiwitten die daar op lijken, leidt tot een verstoorde expressie van CD49d maar ook tot een verstoorde activatie van de macrofaag. Eén van de eiwitten die tot deze verstoorde activatie kan leiden is fibronectine, wat in verhoogde mate aanwezig is in de NOD pancreas. Deze factoren tezamen kunnen bepalend zijn voor de ongewenste beschadiging van de eilandjes door de macrofagen in de NOD muis. De orgaan-specifieke afwijkingen in combinatie met de door ons gevonden defecten in de NOD macrofaag kunnen het lokale evenwicht in de pancreas verstoren, mogelijk gevolgd door schade aan de eilandjes en de initiatie van een specifieke immuunrespons. De beschreven resultaten bieden mogelijk de basis voor een nieuwe hypothese voor het onstaan van lokale activatie van pancreas macrofagen. Ook macrofagen van patiënten met type 1 diabetes vertonen een verstoorde respons op hetzelfde ligand als door ons is getest in de NOD muis. Wij hopen dat met onze bevindingen in de NOD muis een nieuwe weg kan worden geopend in het onderzoek naar het ontstaan van type 1 diabetes in de mens.