Rôle de la glycosylation et de la galectine-4 dans l'adressage à la membrane apicale dans les cellules HT-29 5M12 de phénotype entérocytaire

• Auteur / Autrice : Delphine Delacour
• Direction : Guillemette Huet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Lille 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines membranaires

Galectines

métabolisme

Dipeptidyl peptidase 4

Cellules HT29

Protéines membranaires

Galectines

Métabolisme

Dipeptidylpeptidase IV

Entérocytes

Résumé

La polarisation des cellules épithéliales dépend de mécanismes finement régulés pour le ciblage des protéines et lipides vers les différents domaines membranaires. Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que le traitement des cellules polarisées de la lignée HT-29 par l'inhibiteur de glycosylation GalNAca-O-benzyl provoquait une inhibition de la sécrétion des mucines, et une altération de la distribution des glycoprotéines de la bordure en brosse telle que la glycoprotéine transmembranaire dipeptidylpeptidase-IV (DPP-IV), celles-ci s'accumulant à l'intérieur de la cellule. En revanche, cet inhibiteur épargnait les glycoprotéines de la membrane basolatérale. Cette observation laissait entendre un rôle de la glycosylation au niveau du contrôle du trafic intracellulaire vers le pôle apical, et l'effet du GalNAca-O-benzyl pouvait se situer soit au niveau de la voie d'exocytose, soit au niveau de la voie de recyclage. Pour répondre à cette question, nous avons étudié la distribution de protéines de la famille des SNAREs, et la sécrétion d'une forme soluble de la dipeptidylpeptidase-IV murine, amputée de son domaine transmembranaire donc non internalisée, en utilisant le modèle des cellules HT-29 5M12 de phénotype entérocytaire. Les résultats ont montré que le GalNAca-O-benzyl bloquait la voie antérograde vers la surface apicale. Au niveau biochimique, une altération des microdomaines membranaires de type radeaux lipidiques (rafts) a été mise en évidence. L'hypothèse d'un mécanisme d'adressage à la membrane apicale basé sur une lectine a alors été proposée. Par une approche protéomique, nous avons identifié une lectine dans les microdomaines membranaires des cellules HT-29 5M12, la galectine-4, et montré la quasi-disparition de cette lectine dans les rafts des cellules traitées par le GalNAca-O-benzyl. L'étude de la distribution de cette lectine a montré sa présence au niveau du TGN, des vésicules post-golgiennes, et de la membrane plasmique apicale. Nous avons démontré que la galectine-4 était associée aux rafts via une interaction avec des glycosphingolipides sulfatés (sulfatides) substitués par des longues chaînes d'acides gras insaturés. Le rôle fonctionnel de la galectine-4 dans l'adressage apical a été ensuite étudié avec l'utilisation de la technique de l'ARN interférence. L'inhibition de l'expression de la galectine-4 dans les cellules HT-29 5M12 a entraîné la perte de la localisation apicale des marqueurs de la bordure en brosse avec leur accumulation à l'intérieur de la cellule. En conclusion, nos résultats nous ont permis de montrer un rôle fonctionnel de la galectine-4 associée aux sulfatides dans l'adressage apical via les rafts.

Epithelial cell polarity depends on highly regulated mechanisms for targeting proteins and lipids to the apical or basolateral plasma membrane. We previously reported that the inhibitor of glycosylation GalNAca-O-benzyl inhibited mucin secretion and altered the localization of brush border glycoproteins such as the transmembrane dipeptidylpeptidase-IV (DPP-IV) which accumulated intracellularly. In contrast, no alteration was observed for basolateral glycoproteins. These observations led us to hypothesize for a role of glycosylation in intracellular trafficking, and GalNAca-O-benzyl could affect the exocytosis or the recycling pathway of apical proteins. To answer to this question, we studied the cellular distribution of SNARE proteins and the secretion of a murine soluble form of DPP-IV, which does not follow the endocytosis / recycling pathway, using HT-29 5M12 cells of enterocytic phenotype. Results showed that GalNAca-O-benzyl induced a block on the anterograde biosynthetic pathway towards the apical membrane. Furthermore, GalNAca-O-benzyl altered the composition of lipid-rich microdomains. Thus, the hypothesis of a lectin-based mechanism was raised. By proteomics analysis, we have identified galectin-4 as a major component of raft microdomains. This lectin was no more raft-associated after GalNAca-O-benzyl treatment. In HT-29 5M12 cells, galectin-4 was localized in TGN, post-Golgi carrier vesicles, and at the apical membrane. The functional role of galectin-4 in polarized trafficking in HT-29 5M12 cells was studied by using a retrovirus-mediated RNA interference (RNAi). In galectin-4-depleted HT-29 5M12 cells apical membrane markers accumulated intracellularly. In contrast, basolateral membrane markers were not affected. Moreover, galectin-4 depletion altered the DRM association characteristics of apical proteins. Sulfatides with long chain-hydroxylated fatty acids, which were also enriched in DRMs, were identified as high-affinity ligands for galectin-4. Taken together, our data propose that interaction between galectin-4 and sulfatides plays a functional role in the organization of lipid rafts for apical delivery.