Recherche Avancée

Thèse soutenue

Identification de la séquence de fixation à l'ADN et de recherche de gènes cibles du produit du gène suppresseur de tumeurs HIC1

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Auteur / Autrice : Sébastien Pinte
Direction : Dominique Leprince
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
Date : Soutenance en 2004
Etablissement(s) : Lille 2

Résumé

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Hic1 (Hypermethylated In Cancer 1) est un gène localisé en 17p13. 3, une région fréquemment délétée et/ou hyperméthylée dans de nombreux cancers humain courants. La réintroduction de hic1 , par transfection stable en cellules cancéreuses, inhibe leur croissance et/ou leur viabilité en culture ; de plus, les souris hétérozygotes hic+/- développent tardivement des tumeurs spontanées contrairement aux souris sauvages. Tous ces résultats montrent que le gène hic1 est un gène suppresseur de tumeurs. Le produit du gène hic1 est un facteur de transcription de 714 acides aminés. Il possède, du côté N-terminal, un domaine BTB/POZ permettant d’homo- et hétérodimériser, de réprimer la transcription et d’interagir avec des partenaires protéiques, encore inconnus. Il possède également, au niveau de sa région centrale, un motif de recrutement du co-répreseur CtBP (C-termial Binding Protein). Il présente enfin, du côté C-terminal, cinq doigts de zinc de type Krüppel C2H2 constituant le domaine de fixation à l’ADN (DBD pour DNA Binding Domain). Dans un premier temps, nous avons déterminé la séquence concensus de fixation à l’ADN de HIC1 (HiRE pour HIC1 Response Element) par la technique de SAAB (Selection And Amplification of Bindings sites) : 5’-C/G NG C/G GGGCA C/ACC-3’. A l’aide de cette séquence, nous avons étudié les propriétés de fixation à l’ADN de HIC1. Les résultats ont montré que le domaine BTB/POZ inhibe la fixation de HIC1 sur un site HiRE unique en expérience de retard sur gel, mais permet une fixation coopérative sur une sonde contenant cinq sites HiRE concatémérisés (sonde 5HiRE). En se fixant sur cette séquence 5HiRE, la protéine HIC1 surexprimée ou endogène est capable de réprimer la transcription d’un gène rapporteur luciférase in cellulo. Dans un second temps, à l’aide des ARN totaux de cellules infectées par un adénovirus exprimant les protéines HIC1 ou GEP en contrôle, nous avons effectuer une recherche de gènes cibles de HIC1 par al technique de miccroarrays. Deux gènes cibles putatifs, snap43 et cycline D1, sont réprimés dans ces expériences d’arrays, possèdent dans leurs promoteurs respectifs des éléments de réponse putatifs à HIC1 et sont impliqués dans le contrôle de la croissance et du cycle cellulaire. La répression de ces gènes a été confirmée au niveau ARN et protéique et la fixation de HIC1 sur leurs promoteurs endogènes a été montrée par la technique de ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation assay). Les résultats de mon travail de thèse nous ont permis de mieux comprendre comment l’extinction de l’expression transcriptionnelle du gène hic1 dans les cancers, peut être un facteur participant à la transformation de différents types cellulaires in vivo.