Mécanismes de la sécrétion des toxines ExoS et ExoT par le système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : séquence d'adressage et rôle de la chaperonne SpcS

Secretion mechanisms of ExoS and ExoT by the type III secretion system of pseudomonas aeruginosa : signal sequence and role of teh SpcS chaperone

• Auteur / Autrice : Lauriane Quenee
• Direction : Benoît Polack
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie et sciences du vivant
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Résumé

Pseudomonas aeruginosa, pathogène opportuniste, est responsable d'infections nosocomiales et d'infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose. L'un des facteurs déterminants dans la virulence de cette bactérie est son système de sécrétion de type III (SSTT). Le SSTT permet aux bactéries d'injecter des toxines directement dans le cytosol d'ne cellule eucaryote cible. Ce facteur de virulence peut être aussi considéré comme un système biologique de transfert de protéines. Nous avons donc défini les modalités d'utilisation de la souche CHA de P. Aeruginosa comme outil de vectorialisation. L'invalidation des gènes exoS et exoT a permis de créer une souche peu toxique pour les cellules eucaryotes, qui présente une capacité d'injection accrue pour les protéines d'intérêt. Des protéines de fusion ont été réalisées avec différents segments N-terminaux de ExoS et des protéines rapporteuses. La capacité de ces protéines à être produites et injectées par le SSTT de la souche CHA, a permis de définir la séquence d'adressage permettant l'injection optimale dans une cellule cible. Les 54 premiers acides aminés de ExoS sont le meilleur compromis entre un domaine minimum de la toxine native et une information suffisante pour un adressage efficace vers le SSTT. Le gène orf1 code pour une chaperonne spécifique : SpcS, qui interagit avec les toxines ExoS et ExoT dans le cytosol de la souche CHA et favorise leur sécrétion, sans pour autant être indispensable à un mécanisme ou à la toxicité bactérienne. Avec le complexe ExoS/Spcs nous avons copurifié la protéine CysB. Cette protéine est un nouvel inhibiteur du SSTT, impliqué dans une voie de régulation encore indéterminée.

Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous and opportunistic pathogen. It uses type three secretion system (TTSS) to inject effector proteins directly into the cytosol of target cells. This sytem can also be considered as a protein transfer system. We have defined a way to turn the P. Aeruginosa CHA strain as a bacterial protein vector. Deletion of exoS and exoT generated a non toxic strain was able to inject protein transfer system. We have defined a way to turn the P. Aeruginosa CHA strain as a bacterial protein vector. Deletion of exoS and exoT generated a non toxic strain was able to inject proteins into the cytosol of a target cell. Fusion proteins were realized with the N-termina domain of ExoS. They were produced and secreted by the TTSS of the CHA strain, allowing to emphasize that the signal sequence for TTSS secretion was encoded by the 54 first amino acids of the toxin. We have also shown that the orf1 gene encodes a type III chaperone, SpcS, which was able to interact with ExoS and ExoT in the cytose of the bacteria. SpcS increased the secretion of these toxins, but was not compulsory for secretion neither for toxicity. With the ExoS/Spcs complex, CysB has also been copurified. This protein was a negative regulator of TTSS expression but was involved in a still non described regulatory pathway.