Développement de modèles animaux pour l'étude des agents infectieux hépatotropes viraux

Animal models development for study of the viral hepatotrope agents

• Auteur / Autrice : Serban-Zaharia Morosan
• Direction : Françoise Lunel-Fabiani, Mihai Carp-Carare
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Angers
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Hélène Gilgenkrantz

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tests de toxicité in vivo

Cellules hépatiques

Hépatotoxicité

Modèles animaux

Foie -- Régénération (biologie)

Résumé

La repopulation du foie par avantage sélectif des hépatocytes humains réimplantés sur les hépatocytes résidents, ouvre d'incontestables possibilités pour l'étude des agents infectieux à tropisme hépatique capable d'infecter uniquement les hépatocytes humains. L'obtention d'un modèle murin permettrait donc de mieux comprendre les mécanismes d'infection et de réplication par le VHC, le VHB et le Plasmodium falciparum afin de mieux appréhender leur potentiel pathogénique et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. L'objectif de mon travail a été de reproduire le modèle murin de régénération hépatique (Alb-uPA/SCID) et d'améliorer ce modèle en diminuant le rejet de la greffe. Pour cela les souris ont été traitées afin de diminuer l'activité des macrophages et des cellules NK. Une amélioration du maintien et de la survie des hépatocytes humains transplantés chez les souris traitées a été constatée par une augmentation significative de la sécrétion de l'albumine et de l'alpha 1 anti-trypsine humaine ainsi que du nombre de foyers d'hépatocytes humains. De plus, le niveau de la différenciation hépatocytaire a été confirmé par la susceptibilité des hépatocytes humains à l'infection par le Plasmodium falciparum. Nous avons pu valider un nouveau protocole, ex vivo, de transfert de gènes dans des hépatocytes humains à l'aide d'un vecteur FLAP-ADN lentiviral. Le repeuplement du foie de souris Alb-uPA/SCID par les hépatocytes génétiquement modifiés à l'aide d'une technique de transduction ex vivo des hépatocytes en suspension est un point très important qui soutien l'idée de thérapie génique du foie. Ce protocole peut être appliqué dans les différentes pathologies du foie : hémophilies A et B, maladie de Pompe, maladie de Tay-Sachs… Hélène Strick-Marchand et coll. Ont isolé et caractérisé in vitro plusieurs lignées hépatiques embryonnaires [cellules nommées BMEL (« bipotential mouse embryonic liver »)] à partir de souris sauvages de fond génétique différent. Ces lignées sont composées de cellules bipotentielles, ayant la capacité de se différencier en hépatocytes ou en cholangiocytes après induction. Dans les conditions expérimentales testées, les cellules BMEL-GFP participent à la régénération hépatique chez la souris Alb-UPA/SCID. De plus, nos résultats démontrent que des lignées cellulaires non-transformantes sont capables in vivo de se différencier en hépatocytes et en cellules biliaires. Les hépatocytes en culture permettent des études de pharmacotoxicité mais la disparition précoce du cytochrome P450 et de certains enzymes du métabolisme limite l'utilisation des hépatocytes humains cultivé in vitro. Il n'existe pas actuellement de système pouvant reproduire le métabolisme hépatique in vivo. La détection (par RT-PCR en temps réel) de plusieurs sous-familles de cytochromes P-450 chez la souris avec un « foie humanisé » démontre que les hépatocytes humains ainsi transplantés ne perdent pas les facultés de synthèse des nouveaux enzymes hépatiques, en particulier des enzymes du cytochrome P450. De ce fait, l'obtention, le maintien et la multiplication d'hépatocytes humains constituent un enjeu stratégique important pour l'étude de l'hépatotoxicité des médicaments in vivo.

Human hepatocytes are essential for medical research, however are in very limited supply. Il has been recently reported that immunodeficient mice can be engrafted with human hepatocytes that remain susceptible to some extent to HBV and HCV. We combined these finding with previous indication that depletion of non-adaptative defences was critical to the survival of heterologous grafts. In Alb-upA/SCID mouse, the depletion of macrophages and NK cells dramatically improved the survival of human hepatocytes. The differentiation status of transplanted human hepatocytes was further confirmed by their receptivity to Plasmodium falciparum liver stages development for which no permissive cell line exist. In the present study, we have shown that primary human and rat hepatocytes can be efficiently transduced with a FLAP lentiviral vector without the need for plating and culture. Moreover, transplanted into Alb-uPA/SCID mouse liver, lentivirally transduced primary human hepatocytes extensively repopulated their liver and maintained a differentiated and functional phenotype as assessed by stable detection of human albumin an antitrypsin in the serum of the serum of the animals for months. This work therefore opens new perspectives for the development of human clinical trials based on liver-directed ex vivo gene therapy. Hélène Strick and al. Show that bipotential mouse embryonic liver (BMEL) cell lines are bipotential and differentiate into both hepatocyte and bile ducts. In this study we show that BMEL stem cell lines participate in liver regeneration in Alb-uPA/SCID transgenic mice. In the liver, the BMEL cells proliferate and differentiate into hepatocytes and bile ducts. This is the first report that immortalized stem cell lines not only are competent to participate in the repair of a damaged tissue, but that they can differentiate into two major epithelial cell types of a complex organ, hepatocytes and bile ducts. Once obsorbed, a drug under goes a collection of complex mechanisms of transformation, resulting in its elimination. Among the enzymatic system involved in the detoxification, the cytochromes P450 are, in most cases, responsible of the metabolism of drugs in the liver. In this study, we show that the livers of the Alb-uPA/SCID mice (transplanted with human hepatocytes) expressed a lot of Cytochromes P450 involved in the metabolism of drugs.