Etude de la maurocalcine, une toxine issue de venin de scorpion : Un outil pour l'analyse de l'activité du récepteur sensible à la ryanodine dans le muscle squelettique

Study on a scorpion toxin, maurocalcine : a tool to analyse calcium channel-ryadine receptor in skeletal muscle

• Auteur / Autrice : Eric Estève
• Direction : Hervé Rochat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance en 2004
• Etablissement(s) : Aix-Marseille 2

Mots clés

Mots clés contrôlés

Muscles -- Contraction

Récepteurs cellulaires

Ryanodine

Venin

Scorpions

Toxines

Résumé

La maurocalcine (MCa) est une toxine de venin de scorpion, active sur un canal, situé dans la membrane du réticulum sarcoplasmique (RS) et permettant la libération du calcium de ce compartiment cellulaire. Ce canal, sensible à la ryanodine (RyR1), est impliqué dans le phénomène d'excitation-contraction de la cellule musculaire squelettique. Nous avons utilisé l'activité pharmacologique de la maurocalcine pour comprendre le fonctionnement de ce canal lors de la contraction musculaire. La maurocalcine potentialise la fixation de la [3H]ryanodine sur des vésicules isolées de RS (7 fois à pCa 5) et présente une EC50 apparente de 12 nM. La synthèse peptidique a permis de fabriquer des mutants de la maurocalcine pour connaître le rôle joué, dans son activité, par certains des acides aminés composant la séquence de la toxine. Le mutant [Ala24]MCa a mis en évidence l'importance d'un acide aminé de la séquence pour la fixation et l'action de la toxine sur le récepteur. Lors d'enregistrements d'activité du canal en bicouche lipidique reconstituée, l'application de 200 nM de maurocalcine induit un état de sous-conductance persistant (LLSS) du RyR1 qui correspond à 60 % de sa conductance maximale. Cet état, représentant 54. 8 ± 6. 2 % du temps d'enregistrement de l'activité du canal, montre une partie du mécanisme du RyR1 qui sert à moduler précisément les flux de libération du calcium in vivo. Une application de 100 nM de maurocalcine dans une culture de myotubes induit une augmentation rapide (3 secondes) de calcium cytoplasmique, observée en fluorescence par microscopie confocale. Cet événement implique la capacité de la toxine à traverser la membrane de la cellule. Par ces travaux utilisant de nombreuses d'approches, je pense avoir mis en évidence une partie du mode d'action du RyR1, grâce à la maurocalcine qui s'est révélée être un effecteur puissant et spécifique de ce canal

Maurocalcine is a scorpion toxin active on intracellular released calcium channels of sarcoplamic reticulum. These ryanodine sensible channels (RyR1) are involved in the excitation-contraction mechanism on the skeletal muscle cell. I studied the activity of RyR1 by the way of this toxin to determinate the exact role of this channel during muscular contraction. MCa strongly potentiates [3H]ryanodine binding on SR vesicles (7-fold at pCa5) with an apparent EC50 of 12 nM. Chemical synthesis permitted to create mutants of maurocalcine that showed the importance of each amino acid residue in the toxin biological activity. The mutant [Ala24]MCa allows to revealed a critical amino acid residue in the sequence to determine the binding affinity and the calcium release efficacy of maurocalcine on RyR1. Single channel recordings show that application of 200 nM of maurocalcine induces a characteristic long-lasting subconductance state (LLSS). This state represents 60% of the full conductance state and the channel spends 54. 8 ± 6. 2% of its time in this subconductance level. The RyR1 can precisely modulate calcium flux. We next analyse the effect of MCa (100 nM) on cytosolic calcium concentration by observing, by confocal microscopy techniques, changes in fluorescence levels on cultured myotubes. MCa induces a rapid (3 seconds) increase of cytoplasmic calcium demonstrating that this toxin has the ability to cross the cytoplasmic membrane of skeletal muscle cells. Elements concerning toxin penetration and proportional gating imposed by MCa, reflecting an iris mechanism of conductance of RyR1, have to be detailed. These various technical approaches partly revealed the RyR1 activity mechanism and designated MCa as a powerful and specific effector of this channel