Développement de statégies moléculaires permettant d'importer des séquences d'intérêt dans les mitochondries des cellules végétales

Development of molecular strategies enabling the import of sequences of interest into plant mitochondria

• Auteur / Autrice : Clarisse Valentin
• Direction : André Dietrich
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire des plantes
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plantes -- Cytogénétique

Transformation génétique

Plantes -- Expression génique

Phytovirus

Aminoacyl-ARNt synthétases

ARN de transfert

Mitochondries végétales

Résumé

Aucune méthodologie permettant de transformer génétiquement les mitochondries des plantes supérieures n'a pu être définie jusqu'à présent, soit pour des raisons de sélection, soit à cause de la taille des organelles. Il n'est donc pas possible à l'heure actuelle d'agir sur l'expression génétique mitochondriale. Dans ce contexte, nous avons cherché à exploiter des mécanismes physiologiques pour importer des acides nucléiques dans les mitochondries de plantes in vivo. La première stratégie met à profit le mécanisme naturel d'importation des ARNt du cytosol dans les mitochondries. Nous avons utilisé la structure aminoacylable de type ARNt (TLS pour ''tRNA-like Structure'') formée par les 82 derniers nucléotides de l'extrémité 3' de l'ARN du TYMV (''Turnip Yellow Mosaic Virus'') comme vecteur d'importation mitochondriale. Nous avons montré que la TLS est importée dans les mitochondries in vivo et qu'elle peut transporter une séquence-passagère. La seconde approche est l'utilisation de la protéine VirE2 d'Agrobacterium tumefaciens comme canal d'importation d'acides nucléiques. En effet, au cours de l'agroinfection, cette protéine forme un canal à travers la membrane plasmique de la cellule infectée et facilite le passage de l'ADN-T. Nous avons montré que la protéine VirE2 s'intègre dans les membranes mitochondriales in vitro et que des mitochondries isolées prétraitées avec la protéine VirE2 voient leur perméabilité augmenter en présence d'ADN. D'autre part, nous avons caractérisé dans la protéine mineure de capside du BNYVV (''Beet Necrotic Yellow Vein Virus'') une séquence atypique qui permet l'adressage mitochondrial des particules virales. Cette séquence pourra être utilisée afin de diriger la protéine VirE2 vers les mitochondries in vivo. Une fois ces méthodologies opérationnelles, nous développerons des approches antisens permettant d'agir sur le taux et/ou la traduction d'ARNm dans les mitochondries des cellules végétales in vivo.

To date, no methodology has been described to genetically transform higher plant mitochondria, either for selection reasons or due to the size of these organelles. Therefore, it is currently not possible to manipulate mitochondrial gene expression. In this context, we tried to exploit physiological mechanisms to import nucleic acids into plant mitochondria in vivo. The first strategy takes advantage of the naturally existing mechanism of tRNA import from the cytosol into mitochondria. We used the aminoacylatable tRNA-like structure (TLS) formed by the 82 terminal nucleotides of the 3' end of the TYMV (Turnip Yellow Mosaic Virus) RNA as a vector for import into mitochondria. We showed that the TLS is imported into mitochondria in vivo and that it can transport a passenger sequence. The second approach makes use of the Agrobacterium tumefaciens VirE2 protein as a channel for the import of nucleic acids. During agroinfection, this protein does form a channel across the plasma membrane of the infected cell to facilitate the translocation of the T-DNA. We showed that the VirE2 protein integrates into the mitochondrial membrane in vitro and that isolated mitochondria pretreated with VirE2 protein have an increased permeability in the presence of DNA. We also characterized an atypical sequence in the minor coat protein of the BNYVV (Beet Necrotic Yellow Vein Virus) which permits the mitochondrial targeting of the viral particles. This sequence will be suitable to direct the VirE2 protein to the mitochondria in vivo. Once these methodologies will be operational, we shall develop antisense approaches to act on the level and/or translation of specific mRNAs in the mitochondria of plant cells in vivo.