Quand la fourche de réplication rencontre une lésion in vivo : Analyse moléculaire et cinétique

• Auteur / Autrice : Vincent Pagès
• Direction : Robert Fuchs
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN polymérases

PCR (génétique)

Cancérogènes

Escherichia coli

ADN -- Réplication

Résumé

Le génome des cellules est constamment soumis à des agressions exogènes (rayonnement UV, composés chimiques) ou endogènes (dommages oxydatifs). Ces agressions ont pour conséquence de créer des lésions sur l'ADN. Au cours de la réplication du chromosome, la machinerie réplicative de la bactérie Escherichia coli va rencontrer certaines de ces lésions qui n'ont pas été réparées. Ces lésions constituent un obstacle pour la polymérase réplicative. De nombreuses questions se posent :-Que se passe-t-il au niveau de la lésion et de la polymérase bloquée ?-Que devient la fourche de réplication dont l'un des brins est bloqué ?Afin de répondre à ces questions, nous avons mis au point une technique qui permet d'étudier la cinétique de synthèse de chacun des brins d'un plasmide, portant une lésion ou non, au sein d'une bactérie. Ainsi, nous avons pu déterminer que le temps nécessaire à la réplication au travers d'une lésion modèle que forme le cancérogène Acétylaminofluorène (AAF), est d'environ 50 minutes. Nous montrons également que ce temps de passage dépend du contexte de séquence et de la nature de la lésion. L'analyse des intermédiaires de réplication bloqués au niveau de la lésion a permis de mettre en évidence une inhibition partielle de l'activité de correction de lecture (proofreading) de la polymérase réplicative, dépendante de l'induction du système SOS. L'analyse de la cinétique de réplication des deux brins (endommagé ou non) d'un plasmide a permis de montrer un découplage transitoire de la synthèse des deux brins probablement suivi d'un blocage définitif de la fourche de réplication : ces phénomènes sont nécessaires à la formation de structures dites de ''fourches régressées'', structures intermédiaires essentielles à la mise en place de mécanismes qui vont assurer la continuité du brin en cours de synthèse, et ainsi restaurer une fourche de réplication intacte.

Genomes of all living organisms are constantly injured by exogenous and endogenous agents that modify the chemical integrity of DNA. During chromosomal replication, the replicative machinery of Escherichia coli in-avoidably encounters DNA lesions that have escaped the various excision repair pathways, blocking the progression of the replicative DNA polymerase and thus raising several key questions:-What happens to the polymerase blocked at the lesion?-What is the fate of a replication fork in which synthesis is blocked in one strand?In order to answer these questions, we set up an assay that allow to monitor in vivo, the kinetics of replication of both strands of a DNA molecule containing a single replication block. Hence, we managed to determine that bypass of a model DNA replication-blocking lesion formed by the binding of the chemical carcinogen N-2-acetylaminofluorene (AAF) to guanine residues requires about 50 minutes. It was also found that this time depends upon the sequence context and the chemical nature of the lesion. Moreover, the fine analysis of the replication intermediate pattern in the vicinity of the lesion allowed us to ''visualize'' a partial inhibition of the proofreading activity of the replicative polymerase (PolIII), dependant upon SOS-induction. Analysis of the kinetics of replication of both damaged and undamaged strands of a plasmid, revealed transient uncoupling of leading- and lagging-strand DNA replication. Lagging strand synthesis proceeds beyond the block in the leading strand over a distance > 1 kb before the whole fork will probably block. These events are essential to generate ''regressed forks'', intermediate structures that allow the damaged strand to be rescued and a normal replication fork to be restored.