Thèse soutenue

Analyse quantitative des interactions moléculaires au cours de la transfection par des complexes ADN/polyéthylèneimines

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Auteur / Autrice : Jean-Pierre Clamme
Direction : Yves Mély
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Date : Soutenance en 2003
Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de concevoir l'utilisation de l'ADN en temps qu'agent thérapeutique pour le traitement de maladies génétiques héréditaires (mucoviscidose,myopathie) ou acquises (cancer). Le succès de la thérapie génique repose sur la mise au point de vecteurs capables de transférer le gène d'intérêt thérapeutique au sein de la cellule. Dans ce cadre nous avons étudié la formation, la composition et le devenir cellulaire de complexes entre l'ADN et l'un des vecteurs synthétiques de transfert de gène le plus prometteurs: la polyéthylèneimine. Dans un premier temps, les études menées par microscopie confocale ont permis d'identifier les étapes limitantes de la transfection des cellules L929 par les complexes ADN/PEI. En effet, les marquages de l'ADN par le YOYO-1, du PEI par la Rhodamine et l'utilisation d'une sonde de suivi de l'endocytose le FM4-64, ont permis de montrer qu'après internalisation par endocytose en phase fluide, les complexes étaient majoritairement retenus dans les endosomes tardifs autour du noyau réduisant ainsi le passage de l'ADN vers ce dernier et limitant de ce fait l'efficacité de transfection du PEI. Dans un deuxième temps, la mise en place d'une plate-forme de spectroscopie à corrélation de fluorescence par excitation biphotonique, nous a permis de suivre la formation et la dissociation des complexes in vitro ainsi que d'en caractériser la composition. Ainsi, nous avons montré que les complexes contenaient en moyenne 3 plasmides et que lors de leur formation 85% du PEI restait libre en solution. Ce dernier point est susceptible d'être à l'origine de la toxicité observée lors de la transfection des cellules L929. Par ailleurs, des études de FCS en milieu cellulaire ont permis de mettre en évidence la présence de PEI libre dans l'ensemble des compartiments cellulaires et une importante interaction entre le PEI les constituants intracellulaires.