Thèse soutenue

Caractérisation moléculaire et mécanisme d'action de la pullulanase type II (TH-Apu-Delta2) isolée chez l'archaeum hyperthermophile "Thermococcus Hydrothermalis"
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Auteur / Autrice : Florent Chang-Pi-Hin
Direction : Michael O'DonohueFrancis DuchironPhilippe Debeire
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
Date : Soutenance en 2003
Etablissement(s) : Reims

Résumé

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Les besoins de l'industrie en nouveaux outils biotechnologiques, notamment des enzymes thermostables, ont conduit précédemment à l'isolement chez une " archaea " hyperthermophile " Thermococcus hydrothermalis " de plusieurs glycosyl-hydrolases, dont une pullulanase type II. L'identification et le séquençage du gène codant pour cette dernière a abouti au clonage et à l'expression du domaine catalytique de l'enzyme chez " E. Coli ". Ce domaine, désigné Th-ApuD2, correspond à une protéine de 88469 Da, composée de 770 acides aminés. Comme toute pullulanase type II, Th-ApuD2 est capable d'hydrolyser aussi bien les liaisons a-(1,6) du pullulane que les liaisons a-(1,4) de l'amylose. Par ailleurs, elle appartient à la famille 57 des glycosyl-hydrolases, une famille pour laquelle il existe très peu d'informations et aucune description de structure tridimentionnelle. Dans la présente étude, de manière à élucider les bases de la bi-fonctionnalité de Th-ApuD2 et d'enrichir les connaissances des enzymes de la famille GH57, une caractérisation biochimique approfondie a été conduite. L'étude de la spécificité de substrat et du mode ont permis de décrire Th-ApuD2 comme une exo-enzyme qui dégrade le pullulane ou l'amylose par l'extrémité réductrice. De plus, la caractérisation des modes d'inhibition de différentes molécules ainsi que la détermination des paramètres cinétiques d'hydrolyse d'une gamme variée de substrats ont conduit non seulement à prouver l'existence d'un site actif unique, responsable des deux activités hydrolytiques, mais aussi à proposer un modèle d'organisation de ce dernier. En ce qui concerne les deux activités hydroliques de Th-ApuD2, des expériences de mutagène basées sur la comparaison de la séquence de Th-ApuD2 avec d'autres protéines notamment des enzymes de la famille GH57, ont mis en évidence l'importance de trois résidus acides (E291, D313 et D394). L'absence d'activité mesurable des mutants Th-ApuD2-E291A et Th-ApuD2-D394A sur pullulane et amylose indique que ces deux résidus jouent des rôles essentiels dans le mécanisme catalytique.