Caractérisation fonctionnelle de récepteurs olfactifs de mammifères exprimés en lignées hétérologues : étude de l'effet de neuromodulateurs sur des cellules d'épithélium olfactif en culture primaire

• Auteur / Autrice : Grégoire Levasseur
• Direction : Roland Salesse
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences Biologiques. Structure et fonctionnement des systèmes biologiques intégrés
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Olfaction

Protéine G

Lignées cellulaires

Vasopressine

Neurones

Résumé

L'olfaction est un sens primordial qui a une influence importante sur le comportement des animaux. Bien qu'étudié depuis plus d'un siècle c'est seulement depuis un quinzaine d'années que les principaux acteurs moléculaires de la détection des odeurs, notamment les récepteurs olfactifs, ont été identifiés. Malgré cette découverte, les mécanismes moléculaires qui régissent la perception et la signalisation olfactive sont encore largement énigmatiques. Dans le travail qui a mené à cette thèse, j'ai développé un système d'expression hétérologue ou pseudo-homologue en cellules eucaryotes pour caractériser la réponse fonctionnelle de récepteurs olfactifs aux odorants. L'enjeu était de suivre les mécanismes de la détection et de la signalisation olfactive et d'envisager la possibilité d'un criblage des couples récepteurs olfactifs - odorants. Deux récepteurs olfactifs de mammifères, de ligands préférentiels déjà connus ont été utilisés pour développer les méthodes et initier l'étude, le récepteur 17 de rat et le récepteur 17-40 humain. Trois choix prépondérants ont été faits. D'une part, un système ''minimaliste'' d'expression de récepteurs ''intègres'', natifs (ou sans modification de leur séquence primaire), avec seulement une ''étiquette'' c-myc, a été utilisé pour perturber au minimum la reconnaissance du ligand et l'initiation de la signalisation cellulaire. Par contre, les systèmes d'expression ont été multipliés pour déterminer leur influence sur le niveau d'expression fonctionnelle. L'étude comparative a été effectuée sur des cellules de mammifères considérées comme ''usines cellulaires'' (COS, CHO, HEK), une lignée immortalisée issue d'épithélium olfactif de rat (adora). Enfin, la réponse fonctionnelle de clones stables ou de cellules exprimant transitoirement les récepteurs a été principalement étudiée par l'intermédiaire du calcium intracellulaire, second messager impliqué dans la transduction du signal olfactif, en spectrofluorimétrie ou en imagerie calcique. Par ailleurs, la mise au point d'un système de culture primaire de cellules de l'épithélium olfactif, s'est imposée en complément des systèmes d'expression hétérologue. Elle permettrait d'étudier d'une part les récepteurs olfactifs dans les cellules qui l'expriment naturellement, et d'autre part la modulation de ce signal olfactif par l'action de neuromodulateurs, dans le cadre de la régulation de l'olfaction par l'état physiologique, notamment nutritionnel. . . .

Olfaction is dramatically influencing animal behaviour. Despite one century of thorough investigations main molecular actors of the olfactory perception, namely olfactory receptors, have only been identified for a decade. Even with this important discovery, molecular mechanisms underlying olfactory perception and signalisation still remain unclear. During this PhD thesis I've set up a heterologous expression system in eukaryote cell lines in order to characterise a response of receptors to odorants by a functional approach. The aim was to follow mechanisms of olfactory detection and signalisation and to allow the screening of olfactory receptor/odorant pairs. Two olfactory receptors, namely the i7 rat receptor (rORi7) and the 17-40 human receptor (hOR17-40), which already have known ligands (octanal and helional, respectively), have been used in the study. Three leading choice have been made. First, the expression system was chosen as providing a native receptor protein expression with no modification within the intrinsic open reading frame (ORF) of the receptor (which, in the particular case of OR is always free of introns), accepting solely the addition of detection tag sequence (no secretion or import tag) like the c-myc sequence. We thus hoped to limit the possibly interfering events in ligand detection or signalisation triggering. The comparative study as been carried out on mammalian cell lines usually considered as cellular factory (CHO, COS or HEK cells) and on a conditionally immortalized cell line (ODORA) that was derived from the olfactory neuron precursor lineage: globose basal cells. Least, to achieved functional characterisation, I have chosen to focus on the intracellular calcium which is the main second messenger implicated in the olfactory transduction signal. Measurements were achieved using spectrofluorimetric and imaging techniques both in real time. Beside this approach, the use of olfactory cells primary culture quickly appeared as an important tools to complete the studies in heterologous systems. Primary culture of olfactory neurons could allow to study olfactory receptors in their natural hosting cells but also to look for the action of neuromodulators on the olfactory signal transduction. That second point would then offer the possibility of studying the influence of the animal physiological state, including nutritional state, on the olfactory capacity. . . .