Rôle des tétraspanines dans le processus infectieux des champignons phytopathogènes

• Auteur / Autrice : Mathieu Gourgues
• Direction : Marc-Henri Lebrun
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Magnaporthe

Botrytis

Pathogénie

Appressorium

Riz

Résumé

PLS1, un gène identifié au cours d'un programme de mutagenèse insertionelle est nécessaire à l'infection des feuilles de riz par le champignon a scomycète Magnaporthe grisea. Le mutant pls1- différencie des appressoria matures qui sont incapables de différencier l'hyphe de pénétration nécessaire pour percer la paroi des cellules épidermiques des feuilles de son hôte. Le gène altéré chez le mutant pls1 - code pour une protéine de 225 acides aminés proche des protéines de la famille des tétraspanines. Ces protéines animales appartiennent à des complexes membranaires de signalisation intervenant dans le contrôle des processus d'adhésion, de différenciation ou de mobilité cellulaire. Des voies de signalisations similaires pourraient intervenir chez Magnaporthe grisea au niveau du contrôle de la formation de l'hyphe de pénétration. L'utilisation d'une fusion entre la GFP et la protéine Pls1p a permis de montrer que cette protéine est exprimée spécifiquement au niveau des appressoria différenciés aussi bien sur feuilles que sur des surfaces artificielles. Elle est localisée dans la membrane plasmique et les vacuoles des appressoria. Pasque l'ARN messager du gène PLS1 peut être détecté dans toutes les cellules fongiques, cette expression appressorium spécifique est gouvernée par un contrôle de la traduction. Une analyse par délétion à mis en avant le rôle de la région 5' non traduite de l'ARNm de PLS1 dans le contrôle de ce profil d'expression. Des gènes codant pour des tétraspanines ont été recherchés chez d'autres champignons filamenteux. La combinaison d'approches par PCR et par analyse des bases de données publiques a permis d'identifier trois gènes homologues de PLS1 (BcPLS1, NcPLS1 et ClPLS1) chez les champignons ascomycètes Botrytis cinerea, Neurospora crassa et Colletotrichum lindemuthianum. Un seul gène de tétraspanine a été détecté dans le génome des champignons filamenteux. Les quatre gènes identifiés forment une nouvelle famille de tétraspanines qui n'a pu être rapprochée d'aucune des tétraspanines animales. L'analyse fonctionnelle de la tétraspanine BcPls1p a été réalisée par disruption du gène correspondant chez Botrytis cinerea. Le mutant Bcpls1- est non pathogène sur l'ensemble des plantes testées. Les appressoria de ce mutant sont non fonctionnels puisqu'ils ne permettent pas la pénétration des tissus de l'hôte. Ceci est la première démonstration du rôle déterminant de l'appressorium dans le processus de pénétration de B. Cinerea dans la plante hôte. Par conséquent, les deux mutants de tétraspanines pls1- (chez M. Grisea) et Bcpls1- (chez B. Cinerea) sont bloqués au niveau du processus de pénétration. Le point commun à ce processus chez les deux champignons est un arrêt de la croissance apicale suivi d'une redirection de la croissance dans une direction perpendiculaire à la croissance initiale. A l'issue de ce travail, nous faisons donc l'hypothèse que les tétraspanines fongiques pourraient intervenir dans le contrôle de la redirection de croissance qui intervient, chez Magnaporthe grisea et Botrytis cinerea, lors de la pénétration des cellules épidermiques de l'hôte.

PLS1, a gene recovered by insertional mutagenesis is required for penetration of rice leaves by the fungal pathogen Magnaporthe grisea. Pls1- mutant differentiates mature appressoria with normal cellular turgor but fails to differentiate the penetration peg required to breach leaf epidermis or artificial membranes. The protein deduced from the PLS1 sequence is an integral membrane protein of 225 amino acids related to tetraspanin family. These animal proteins are components of membrane signaling complexes involved the control of cell adhesion, differentiation or motility. Similar signaling pathways could be involved in penetration peg formation. Using a GFP-Pls1p fusion, we showed that Pls1p is only expressed in appressoria differentiated on leaves or artificial membranes just before and during penetration, but not in primary infection hyphae. Pls1p is localized in plasma membrane and vacuoles of the appressorium. This specific expression pattern was also analyzed. Pls1p differential expression is regulated at the post transcriptional level, since PLS1 mRNA is detected in all fungal tissus. 5'UTR region is required for this appressorium specific translation of PLS1 mRNA. We wondered if tetraspanin genes are present in other (either pathogenic on plants or saprophytic) fungal species. Using a combination of a PCR based approach and of a computer analysis of public databases we identified three PLS1 homologous genes (BcPLS1, NcPLS1 and ClPLS1) to in the ascomycetes Botrytis cinerea, Neurospora crassa and Colletotrichum lindemuthianum. Only one tetraspanin gene was identified in each fungal genome and the four fungal proteins form a new family of tetraspanin without any homo log within animal tetraspanins. Functional analysis of BcPLS1 gene was performed by knockout in B. Cinerea. Bcpls1- mutant was shown to be non-pathogenic on all plant tested. Bcpls1- mutant appressoria are non-functional as they can not direct the penetration of plant cell wall. This is the first demonstration of the effective involvement of appressoria during B. Cinerea penetration of host leaves. Both pls1- mutant from M. Grisea and Bcpls1- mutant from B. Cinerea are blocked during the penetration process. This process needs apical growth arrest followed by growth redirection. Therefore, we hypothesize that fungal tetraspanin could be involved in growth redirection that is necessary, in Magnaporthe grisea and Botrytis cinerea, for appressorium mediated penetration of plant tissues.