Quelle fonction pour la CLIP-170? : recherche de partenaires et nouveaux outils d'investigation

• Auteur / Autrice : Fabrice Cordelières
• Direction : Jan De Mey
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Lis 1

Microtubule

Kinétochore

Résumé

Le terme de CLIP-170 désigne la protéine de lien cytoplasmique de 170 KDa, isolée par Rickard et Kreis (1990). In vitro, elle constitue un lien statique entre les endosomes et les microtubules (MTs). En chacun des points où la CLIP-170 est localisée, elle se co-distribue avec le complexe moteur dynéine/dynactine (D/D). Les auteurs ont initialement établi un modèle de fonctionnement de concert de ces trois protagonistes: la CLIP-170 établirait le lien initial entre le cargo et le MT. Le complexe D/D serait recruté sur le cargo. Une fois le moteur associé au MT, le lien statique serait levé, rendant possible le mouvement. Ce modèle offrait une explication aux données d'immunolocalisation. Toutefois, le fonctionnement de concert de la CLIP-170 et du moteur moléculaire nécessitait que l'on puisse trouver une interaction entre les protagonistes. Les travaux présentés dans cette thèse apportent pour la première fois la preuve d'une interaction indirecte entre le complexe D/D et la CLIP-170. LIS1 est une protéine codée par le gène causal du syndrome de Miller-Dieker, une forme de lissencéphalie de type I. Elle sert d'adaptateur entre le domaine carboxy-terminal de la CLIP-170 et le complexe moteur dont elle régule l'activité. Nos résultats établissent que le domaine d'interaction de la CLIP-170 avec LIS1 est requis pour l'adressage de la première aux kinétochores prémétaphasiques. Il est nécessaire à l'adressage de LIS1 (et du complexe moteur) aux bouts (+) des MTs interphasiques. Nous présentons deux nouvelles approches permettant d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 tant en interphase qu'en mitose: la microinjection d'anticorps dirigés contre les domaines extrêmes de la protéine, ainsi que l'utilisation de siRNA dirigés contre l'ARNm la codant. Combinées aux techniques de suivi de protéines fluorescentes par vidéomicroscopie 3D développées au laboratoire, elles permettront d'interférer avec le fonctionnement de la CLIP-170 et de définir ainsi son rôle.

CLIP-l70 links endosomes and microtubules (MTs) in vitro. It also treadmills at the +ends of MTs and associates with kinetochores and MT cortical anchors. Its behaviour at MT +ends is that of a +TIPs, of which EB1 is a member. + TIPs recruit molecular complexes at MT +ends to regulate MT dynamics and to mediate cargo loading or interactions with cortical cues. Here we demonstrate interaction between CLIP-170 and LIS1 via its distal zinc fingers. Our results indicate that LIS1 recruitment to kinetochores is dynein/dynactin dependent, and that recruitment there of CLIP-170 is dependent on its binding site to LIS1. Overexpression of CLIP-170 results in a zinc finger dependent localization of phospho-LIS1 and dynactin to MT bundles, raising the possibility that the latter is targeted via phospho-LIS1 and dynein. This work suggests that LIS1 is a regulated adaptor between CLIP-170 and cytoplasmic dynein at sites involved in cargo-MT loading, and/or in control of MT dynamics. We are using expression of siRNA and microinjection of region specific CLIP-170 antibodies, to investigate its functions. A Ct-pAb or a Nt-pAb displaced it from both MT plus ends in interphase and KTs in mitosis. With both pAb, EB1 remained localised to MT +ends while p150^Glued was released into the cytoplasm. In addition, p150^Glued was still localised at unattached KTs. Same results were obtained when CLIP-170 expression leve1 was dramatically diminished by siRNA expression. CLIP-170 antibody microinjection did not dramatically affect mitosis, as determined on fixed cells. These preliminary findings support our model that D/D is addressed to the +TIPs through its interaction with CLIP-170 via LIS1. We are now evaluating by nC 3D videomicroscopy the effects of siRNA expression and microinjection on the interphase MT dynamics and on the poleward sliding of KTs to the mitotic spindle.