Cytomegalovirus et Herpesvirus Humain de type 6 : étude de leur réplication au sein du système hématopoi͏̈étique

Cytomegalovirus and Human Herpesvirus 6 : evaluation of their replication in hematopoietic cells

• Auteur / Autrice : Élisabeth André-Garnier
• Direction : Berthe-Marie Imbert-Marcille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie. Virologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Nantes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie biologie (Nantes....-2008)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virus -- Reproduction (biologie)

Organes hématopoïétiques

Herpesviridés

Cytomégalovirus

Résumé

Le Cytomégalovirus humain (CMVH) et l'Herpèsvirus humain de type 6 (HHV6) sont deux ?- Herpesvirinae présentant un tropisme majeur pour le système hématopoi͏̈étique. Ce travail a visé à évaluer leurs capacités de réplication au cours de la différenciation hématopoi͏̈étique. Des outils méthodologiques autorisant la mise en évidence de la réplication virale ont été développés, permettant la détection de transcrits viraux tardifs par RT-PCR. Parmi les marqueurs développés pour le CMVH, l'ARNm tardif UL22, issu d'un épissage, a montré son intérêt, en particulier dans le cadre du diagnostic de l'infection active/maladie à CMVH. Pour l'HHV6, la détection du transcrit tardif multi-épissé de la gp 82-105 (U100) et la mise en évidence en cytométrie de flux d'antigènes nucléaires tardifs ont été développés à partir de cultures de souches virales de variant B. Ces essais ont permis de préciser que la forme épissée du gène U100 est exprimée en phase tardive du cycle de réplication, alors que la forme non épissée est un marqueur de la phase précoce. La possibilité de survenue d'une réplication des deux virus au cours de l'expansion ex vivo de 10 prélèvements de cellules souches hématopoi͏̈étiques CD34+ périphériques, a ensuite été envisagée. Ces essais ont été réalisés dans le cadre d'une nouvelle approche thérapeutique, qui vise à réduire la durée d'aplasie, chez des sujets traités par hautes doses de chimiothérapie, grâce à l'injection de cellules souches différenciées in vitro. Les cultures ont été menées en milieu liquide, en présence de cytokines permettant d'engager la différenciation vers les lignées myéloi͏̈des et monocytaires. Parmi les quatre cultures de cellules provenant de patients séropositifs pour le CMVH, aucun marqueur de réactivation virale n'a été détecté. A l'inverse, dans 5/10 cultures issues de prélèvements effectués chez les patients séropositifs pour l'HHV6, le transcrit U100 a été amplifié. Ces données montrent pour la première fois et sans avoir recours à une infection préalable par une souche virale, une réplication de l'HHV6 due à une réactivation au cours de la différenciation des progéniteurs hématopoi͏̈étiques. Ces résultats originaux soulèvent le problème de la sécurité virale lors des réinjections chez des patients immunodéprimés de cellules supportant une réplication de l'HHV6.

Cytomegalovirus (CMV) and Human Herpesvirus 6 (HHV6) were two ? -Herpesvirus with a major tropism for hematopoietic system. Since their interactions with hematopoiesis are still poorly understood, we evaluated their replication capacity during differenciation of hematopoietic stem cells. We first developed and evaluated tools to follow viral replication, by detection of late viral transcripts, which assess occurrence of a complete replication cycle. Among the CMV transcripts amplified by reverse transcription-PCR, the late spliced UL22 mRNA was of particular interest, notably to predict the occurrence CMV disease during active infection. For HHV6, a one-step RT-PCR amplifying the late alternatively U100 gene encoding the gp 82-105 glycoprotein and a flow cytometry method to analyse nuclear late antigens were developed from reference strains cultures. Evaluation of these methods was then realized during a sequential culture of HST strain on MT4 cells. This allows to specify that the U100 gene splicing starts at a late stage of multiplication whereas unspliced forms were detectable earlier in the cycle. We then evaluated the occurrence of viral replication during ex vivo expansion of 10 peripheral hematopoietic stem cells (CD34+) samples. Cultures were maintained in a serum free liquid medium supplemented with cytokines of myeloid-monocyte lineage. Neither CMV DNA nor CMV UL22 or UL86 mRNA were detected among the 4 cultures from CMV seropositive patients. Conversely, the late alternatively spliced U100 mRNA (HHV6) was detected at day 14 or 21 in 5/10 cultures from HHV6 seropositive patients. Our data demonstrated for the first time that HHV6 could enter in a replicative cycle during hematopoietic differenciation in the absence of in vitro infection of cells. This also raised the question of the viral safety of the infusion of ex-vivo expanded CD34-positive PBPCs.