Etudes sur les protoplastes de Pelargonium x hortorum Bailey et P. X domesticum Bailey : application à la production d'hybrides somatiques interspécifiques

Studies on protoplast of Pelargonium x hortorum et P. X domesticum : application to interspecific somatic hybrid production

• Auteur / Autrice : Mazen Nassour
• Direction : Noëlle Dorion
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire végétale
• Date : Soutenance en 2003
• Etablissement(s) : Angers

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plantes -- Régénération (biologie)

Hybrides somatiques

Cultures

Protoplastes

Pélargoniums

Résumé

''Dans le but de développer l'hybridation somatique chez les Pelargonium, une méthode d'isolement et de culture de protoplastes ainsi qu'un protocole de régénération de plantes à partir des colonies ont été mis au point. Des plantes de 'Alain ' cultivées in vitro ont servi de plantes mères. Les jeunes feuilles sont, parmi les explants testés (feuille, pétiole, tige, racine), la meilleure source pour l'isolement des protoplastes (2 x 10[puissance]7 protoplastes / g MF), la culture et la régénération, quand les plantes mères sont cultivées en bocaux plutôt qu'en tubes. Les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque la macération enzymatique est réalisée pendant 6h à la lumière dans un milieu contenant les sels minéraux de MS, 0,4 % cellulase Onozuka RS, 0,2 % de pectinase Sigma et 0. 5 M mannitol. Le pourcentage de division diminue quand la concentration d'ammonium et de calcium dans le milieu augmente jusqu'à 5,15 mM et 15 mM respectivement. Les plus forts taux de division (37%) et de formation de colonies (31%) ont été observés pour des densité de 1-5 10[puissance]4 protoplastes /ml, à la lumière en milieu liquide ou en milieu solide contenant respectivement le saccharose et le mannitol comme agent osmotique. Une fréquence de régénération de 12 % a été obtenue en présence d'AIA 0,2 mg l-1 et d'une combinaison de cytokinines (zéatine 1 mg l-1 et BAP 1 mg l-1). Le procédé a été validé sur 5 génotypes de P. X hortorum et 4 de P. X domesticum. Le rendement en protoplastes a été plus élevé chez P. X hortorum (1. 5 - 2 x 10[puissance]7 /g de MF) que chez P. X domesticum (0. 8 - 1. 5 x 10[puissance]7). Tous les P. X hortorum ont montré une capacité de division et de formation de microcolonies élevée (39 et 33 %) contrairement aux P. X domesticum (0,8 % de division sans formation de colonies). Les plantes se sont développées normalement en serre. Les croisements sexués entre P. X hortorum (sensible à Xanthomonas hortorum pv. Pelargonii Xhp) et P. X domesticum (résistant) sont impossibles. L'hybridation somatique par fusion de protoplastes a donc été réalisée. Le PEG ou les chocs électriques ont été utilisés pour réaliser la fusion. Dans certains essais, l'iodoacétamide a été employé pour inactiver le parent ''hortorum''. La ''vigueur hybride'' et la résistance au filtrat de culture de Xhp ont servi à la sélection des produits de fusion. Six plantes en serre, dont 4 fleuries, issues des premiers essais ont été analysées (morphologie, AFLP, cytométrie en flux et comptages chromosomiques). Elles présentent des caractéristiques des deux parents. Pour les autres essais, l'analyse a porté sur les plantes in vitro ou les cals. ''

In order to further develop somatic hybridizations within the genus Pelargonium, a procedure of protoplast isolation, culture and plant regeneration from protoplast-derived calli was set up. Micropropagated plants of Pelargonium x hortorum 'Alain' were used as donor plants. Among the explants tested (leaf, petiole, stem, root), young leaves were the best source for protoplast isolation (2 x 10 7 protoplasts / g FW), culture, and plant regeneration when mother plants were propagated in jars instead of test tubes. The best results were obtained, when enzymatic digestion was carried out under light during 6 h in a medium containing MS mineral salts, 0. 4 % (w/v) cellulase Onozuka RS, 0. 2 % (w/v) pectinase Sigma and 0. 5 M mannitol. Generally, cell division decreased as ammonium and calcium concentrations increased up to 5. 15 mM and 15 mM respectively. The highest frequency of division (37 %) and colony formation (31 %) was observed when protoplasts were plated at 1-5 10 4 protoplasts /ml, under light, in liquid or solid medium containing either sucrose or mannitol as osmoticum. Shoot regeneration (12 %) was obtained on a culture medium containing 0. 2 mg l-1 IAA, and a combination of cytokinins (1 mg l-1 zeatin and 1 mg l-1 BAP). The procedure was tested on 5 genotypes of P. X hortorum and 4 genotypes of P. X domesticum. The yield of protoplasts was higher in P. X hortorum (1. 5 - 2 x 10 7 /g of FW) than in P. X domesticum (0. 8 - 1. 5 x 10 7). All P. X hortorum showed a high capacity for division (up to 39%) and microcolony formation (up to 33%) in contrast to P. X domesticum (0. 8 % division, without colony formation). Plants acclimatized in greenhouse grew normally. Sexual crossing between P. X hortorum (susceptible to Xanthomonas hortorum pv. Pelargonii Xhp) and P. X domesticum (resistant) never succeeded. Therefore somatic hybridization was performed by protoplast fusions that were carried out using PEG or electric treatment. In some experiments, iodoacetamide (IOA) was used to inactivate the ''hortorum'' partner. ''Hybrid vigor'' and resistance to Xhp culture filtrate were used as selection systems. Six plants grown in the greenhouse (4 flowered) were controlled (morphology, AFLP, flow cytometry and chromosome counting). They showed characteristics of both parents. In vitro grown plants and calli arising from the other experiments were also tested for hybridity.