Mise au point de vecteurs non viraux pour la thérapie génique : étude du trafic intracellulaire de complexes ADN plasmidique/polylysines histidylées

Non-viral vectors for gene therapy : study of the intracellular trafficking of plasmid DNA/histidylated polylysine complexes

• Auteur / Autrice : Christine Gonçalves
• Direction : Patrick Midoux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Tours

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Transfert génétique

Thérapie génique

Résumé

L'optimisation de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes et la thérapie génique nous a conduit à l'étude du trafic intracellulaire par cytométrie en flux et microscopie confocale de polyplexes (ADNp/polylysines histidylées et/ou glycosylées) dans les cellules humaines épithéliales des voies aériennes et d'hépatocarcinome. Après internalisation, l'ADNp et les polymères ségrègent dans des vésicules acides différentes : les polyplexes histidylés sont internalisés par endocytose indépendante de l'actine contrairement à ceux lactosylés. L'analyse immunologique de vésicules isolées contenant les polyplexes par cytométrie en flux indique que le plasmide s'accumule dans des vésicules peu acides (pH 6,4) non révélées par des marqueurs d'endocytose. Nous proposons ainsi un mode d'internalisation des polyplexes dans ces cellules. L'isolement et la caractérisation biochimique de ces vésicules permettraient la création de vecteurs plus performants pour le passage de l'ADNp dans le cytosol.

In order to improve synthetic vectors efficiency for gene transfer and gene therapy, the intracellular traffiking of polyplexes (pDNA/ histidylated polylysine and/or glycosylated) was achieved by flow cytometry and confocal microscopy into human airway epithelial cells and human hepatocarcinoma cells. This study shows that polyplexes are rapidely dissociated upon internalization and then pDNA and polymers route in different acidic vesicles. We demonstrated that histidylated polyplexes were internalized by an endocytosis actin-independent process contrary to lactosylated polyplexes. A flow cytometry analysis of vesicles containing polyplexes indicate that the pDNA reaching less acidic vesicles (pH 6,4) are not labelled with the endocytotic markers. We propose a polyplexes internalization model in these cells. The isolation of these vesicles and their biochemical caracterization would help us to design more powerful vectors those increasing especially pDNA delivery into the cytosol.