Mise en évidence de déterminants structuraux impliqués dans les activité biologiques du facteur de croissance HARP (Heparin affin regulatory peptide)

• Auteur / Autrice : Isabelle Bernard-Pierrot
• Direction : Pierre-Emmanuel Milhiet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie, biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris 11
• Jury : Président / Présidente : Geneviève Lemaire
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Geneviève Lemaire, Jean-Jacques Feige, François Radvanyi, José Courty, Marc Vigny
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Jacques Feige, François Radvanyi

Mots clés

Mots clés contrôlés

AlkB enzymes

Syndécane-3

Dimérisation

Facteurs de croissance

Structure moléculaire

Mots clés libres

HARP (Heparin Affin Regulatory peptide)

Résumé

L'HARP (Beparin Affin Regulatory Peptide) est un facteur de croissance de 18 kDa, se liant à l'héparine, fortement exprimé dans les tumeurs primaires humaines d'origine mammaire, gastro-intestinale et prostatique. L'HARP est considéré comme un facteur angiogène favorisant la progression tumorale et la dissémination métastasique. Son implication dans le processus tumoral est liée à ses activités mitogène, angiogène et transformante. L'HARP induit également, in vitro, la croissance neuritique de neurones embryonnaires de rat. Nos travaux, visant à corréler la structure de la protéine avec ses activités biologiques, montrent que l'HARP est capable de former des dimères non covalents en présence d'héparine ou de glycosaminoglycanes et suggèrent que cette forme dimérique est responsable des activités mitogène, angiogène et transformante de la protéine. Nous avons, par ailleurs, mis en évidence l'importance des résidus C-terminaux 111-136 de l'HARP dans le maintien de ces trois activités, alors qu'ils ne sont pas impliqués dans l'activité neurotrope de la protéine. Cette activité semble être exercée par les deux domaines en feuillet de la molécule, contenant chacun un motif de type TSR-1. Nos travaux démontrent également que l'HARP tronqué de ses 25 derniers acides aminés côté C-terminal (HΔ111-136), inhibe les activités mitogène, angiogène et transformante de l'HARP sauvage via une hétérodimérisation avec cette molécule. Le peptide synthétique P111-136 correspondant à cette délétion présente in vitro les mêmes propriétés inhibitrices vis à vis de l'HARP sauvage. Cependant, dans ce cas, l'inhibition est réalisée par compétition avec la protéine HARP au niveau de son site de fixation sur le récepteur cellulaire de haute affinité ALK (Anaplastie Lymphoma Kinase).

Heparin-binding Growth-associated Molecule (HB-GAM) is a heparin-binding molecule involved in neurite outgrowth and is closely related the mammalian produced growth factors Pleiotrophin or HARP reported to stimulate proliferation of several cell types including endothelials. Here, we report that HB-GAM inhibited the biological activity induced by the 165-amino acid form ofvascular endothelial growth factor (VEGF165) on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Endothelial-cell proliferation induced by VEGFI65 showed about 50% inhibition in the presence of HB-GAM in a concentration of 2. 7 nM (ICso). In similar concentrations, HB-GAM blocked HUVEC migration and tube formation induced by VEGF165 in three-dimensional angiogenesis assays. In addition, HB-GAM inhibited binding of 125I-VEGF l65 to the VEGF receptors of HUVEC (IC50 : 35 nM). Additional studies using heparan sulfate deficient CHO cells that overexpressed VEGF receptors indicated that binding of 125I-VEGF165 to fms-like tyrosine kinase-1 receptor, kinase insert domain­containing receptor and neuropilin receptor was inhibited by HB-GAM with an IC50 in the nanomolar range. We then investigated the mechanisms of this inhibition. Using a solid-phase ligand-binding assay, we found that HB-GAM interacted directely with VEGF165, with a dissociation coefficient of 1. 38 nM. Further studies indicated that the two HB-GAM -sheet domains containing the thrombospondin type-1 repeats were involved in this interaction.