Etude de la structuration du ribozyme en tête de marteau à l'aide de complexes du platine

• Auteur / Autrice : Marine Escaffre
• Direction : Jean-Claude Chottard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés contrôlés

Catalyseurs au platine

Ribozymes

Résumé

Le ribozyme en tête de marteau est le plus petit ARN catalytique. Actif dans les conditions physiologiques, il est capable de couper n'importe quel ARN cible y compris lui-même. Il est constitué de trois hélices (I, II et III) appariées par des paires de Watson-Crick et qui forment trois bras en Y (Figure) mais il n'adopte cette structure repliée qu'en présence d'ions métalliques divalents qui jouent un rôle structural et catalytique déterminant mais non encore totalement élucidé. En vue d'augmenter l'activité du ribozyme, notre objectif était de préstructurer sa forme active en stabilisant les mésappariements G-A de son hélice II au moyen d'un adduit interbrins du platine, adduit qui serait obtenu par réarrangement d'un adduit intrabrin, comme décrit en série ADN-ADN. Dans un premier temps, nous avons mis au point une méthode de détection et de quantification des adduits platinés sur une séquence d'ARN. Elle utilise les endoribonucléases T1 et U2 qui coupent sélectivement en 3' des guanosines et des adénosines respectivement et dont les activités sont modifiées par la présence d'un complexe de platine sur ou au voisinage de leur nucléotide-substrat. Dans un deuxième temps, nous avons montré que la réaction de réarrangement du chélate intrabrin du trans-platine en pontage interbrins est possible en série ARN-ARN et qu'elle a lieu en présence de mésappariements GA/GA et dans les conditions salines du repliement du ribozyme. Enfin, nous avons travaillé à la formation du pontage au sein du ribozyme. L'adduit intrabrin a, tout d'abord, été obtenu avec un bon rendement sur un ribozyme alternatif plus court et dont les guanines ne faisant pas partie de l'hélice II ont été remplacées par des N7-déaza guanines, non platinables, puis sur le ribozyme initial grâce à une étape de ligation. Cependant aucun pontage interbrins n'a pu être observé à ce jour, probablement à cause d'une déstabilisation de l'extrémité 5' de l'hélice II au sein de la structure du ribozyme.

Hammerhead ribozyme is the smallest catalytic RNA. Active in physiological conditions, it is able to cleave any target RNA, even itself. It is made of three helices (I, II and III) paired by Watson-Crick base pairs that form three arms shaped in Y (Figure). But it only gets this structured conformation in the presence of divalent metallic ions playing structural and catalytical roles that have not been totally determined. In order to increase the hammerhead ribozyme activity, our aim was to prestructurate its active form by stabilizing its helix II with an interstrand cross-links of platinum. This interstrand cross-links would be formed by rearrangement of an intrastrand adduct, as it bas been described within DNA duplexes. First of all, we have developed a simple analytical method which allows the identification of the platinum binding sites on very small amounts of RNA material. It is based on enzymatic digestion of platinated oligoribonucleotides by ribonucleases T1 and U2 which specifically cleave at the 3'-side of guanosines and adenosines respectively and whose activities are modified in the presence of a platinum complexe near or on their nucleotide target. In a second time, we have shown that the rearrangement of the 1,3-intrastrand cross-link of trans-platinum into interstrand crosslinks also occurs within RNA duplexes, even when the GNGA tandem mismatche is involved in the duplex. Then we tried to cross-link the hammerhead ribozyme. The best reaction conditions for platination were determined and we managed to form the intrastrand cross-link on a shorter RNA strand containing non platinable N7-deaza guanosines, except G8 and G10. 1. Then a ligation reaction gave us the expected intrastrand cross-link on the ribozyme. Nevertheless we could not observe any rearrangement, probably because of the instability of the 5'-side of the helix II of the hammerhead ribozyme.