Etude conformationnelle de la protéine p53 et des interactions avec ses partenaires protéiques

Probing p53 biomolecular interactions and structural properties

• Auteur / Autrice : Virginie Leblanc
• Direction : Evelyne May
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Sv40-ltag

Europium cryptate

Conformation

Résumé

En réponse à différents stress génotoxiques, la protéine suppresseur de tumeur p53 intervient comme gardien de l'intégrité du génome en induisant soit l'arrêt du cycle cellulaire et la réparation de l'ADN, soit l'apoptose. Ceci permet d'éliminer les cellules lésées pouvant être à l'origine d'une tumeur et justifie les espoirs mis dans cette protéine en cancérologie. La conformations de la protéines p53, ses modifications post-traductionnelles et ses interactions avec des protéines cellulaires jouent un rôle prépondérant dans ses activité fonctionnelles. Nous avons appliqué la technique TRACE ®(''Time resolved amplified cryptate emission''), à l'étude des conformations de p53 et de ses interactions avec ses partenaires, en définissant des conditions expérimentales permettant de tenir compte les modifications post-traductionnelles. La technique TRACE® est basée sur un transfert d'énergie de fluorescence entre le cryptate d'europium et l'a1lophycocyanine. Ces fluorochromes ont été greffés à des anticorps dirigés contre deux épitopes distincts de p53 (étude des conformation), ou contre chacun des partenaires d'interaction. Un signal spécifique est détectable par simple addition des anticorps dans un extrait cellulaire brut, sans purification des protéines. Ceci a permis d'étudier la p53 produite dans des cellules humaines et donc de prendre en compte les modifications post-traductionnelles se produisant dans ces cellules. Nous avons identifié i) les interactions spécifiques entre p53 et l'antigène T de SV40, ii) les conformations sauvage et mutée de p53. Nous avons montré que certains mutants présentaient une double réactivités en donnant un signal aussi bien avec le couple d'anticorps caractéristique de la conformation sauvage qu'avec celui caractéristique de la mutée. Ces résultats nous ont conduit à reconsidérer les conclusions de résultats d'immunoprécipitation.

The p53 protein is a tumor suppressor that protects the organism against malignant consequences of DNA damage. Interaction of p53 with numerous cellular or viral proteins regulates its functional activity either positively or negatively. An approach leading to identification of such protein interactions directly in a cell extract could be of help in the development of screening assays to search for drugs acting on p53 in its cellular environment, either by disrupting its association with inhibitory proteins or by increasing its affinity for activating proteins. We show that the Time Resolved Amplified Cryptate Emission (TRACE ®) technology allows identification of such an interaction by simply adding a mixture of two labeled monoclonal antibodies, directly in a cellular extract. We were able to validate this assay by studying p53/SV 40-LTAg interaction. The antibodies directed against genuine p53 and SV40-LTAg epitopes were labeled with either europium cryptate or XL665. We demonstrated that a non radiative fluorescent energy transfer occurs between anti-p53-Eu(K) and anti-SV40-LTag-XL665 labeled antibodies only when p53 interacts with SV40-LTag, which opens up the possibility of extending this approach to other p53 partners to search for drugs that restore p53 tumor suppressor activity. This approach has also be applied to a conformational analysis of the p53 protein by adding, directly in cellular extracts, a pair of labeled monoclonal antibodies specific of either wild type or mutant conformation. Such analysis could be applied to a high throughput screening for compounds that restore the wild type conformation ofp53 in tumor cells.