Etude fonctionnelle des neurones d'horloge et recherche de nouveaux gènes impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens chez la Drosophile

Functional study of the drodophila clock neurons and search for new genes involved in the control of circadian rhythms

• Auteur / Autrice : Eric Blanchardon
• Direction : François Rouyer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Neurones latéraux

Ablation génétique

Mutagénèse de dérégulation

Résumé

Nous avons identifié une lignée de drosophiles (gal1118) porteuse d'un élément P-gal4 ayant une expression restreinte aux neurones latéraux de la Drosophile. L'ablation génétique des neurones latéraux a été réalisée en exprimant des gènes d'apoptose sous contrôle de gal1118. Les mouches générées présentent une forte arythmicité de l'activité locomotrice montrant le caractère indispensable des neurones latéraux pour le contrôle du rythme circadien d'activité locomotrice. L'expression de la chaîne légère de la toxine tétanique dans les neurones latéraux est quasiment sans effets. Nous avons également montré que la perte des neurones latéraux ne perturbe pas les oscillations de la protéine PER dans les autres neurones qui l'expriment, ce qui établit l'autonomie des différents oscillateurs cérébraux. Enfin nous avons observé des oscillations circadiennes de la quantité de neurotransmetteur PDF dans les corps cellulaires des neurones latéraux. Nous avons recherché de nouveaux gènes de l'horloge circadienne par une technique de mutagenèse de dérégulation dans les neurones latéraux utilisant le système GAL4/UAS. 2500 lignées ont été testées pour leur rythme d'activité. 100 lignées présentant des défauts de rythme ont été isolées. En particulier, le mutant UY3113 conduit à un allongement de la période d'activité locomotrice, à un défaut de l'arborisation dendritique et à un affaiblissement des oscillations de PER. UY3113 est inséré en amont d'un gène codant une liprin-α1 dont la surexpression chez le mutant a été confirmée par PCR quantitative. L'utilisation d'un anticorps dirigé contre la liprin-α1 a permis de mettre en évidence l'expression endogène de la liprin dans les neurones latéraux. Nous avons observé chez des mutants hypomorphes une accumulation du PDF dans les corps cellulaires aux dépends des projections axonales et le phénotype inverse chez le mutant de surexpression, ce qui suggère un rôle de la liprin dans le contrôle du transport axonal du PDF.

We isolated a drosophilae strain (gal118) carrying a P-gal4 insertion which is expressed mainly in the lateral neurons. The genetic ablation of the lateral neurons was done by expressing pro-apoptosis genes under control of gal1118. The ablated flies display a strong arrhythmicity of locomotor activity which demonstrates that the lateral neurons are needed to control the circadian rhythm of locomotor activity. Expressing the tetanus toxin light chain in the lateral neurons has nearly no effects. We also demonstrated that the loss of the lateral neurons does not affect PER protein oscillations in the other PER expressing neurons, which shows that the different brain oscillators behave autonomously. At last, we have observed circadian oscillations of the level of PDF neurotransmitter in the cell bodies of the lateral neurons. We searched for new genes of the circadian clock by the use of a misexpression mutagenesis in the lateral neurons, using the GAL4/UAS system. The activity rhythm of 2500 mutant strains was assayed. 100 strains showing rhythm defects were isolated. The UY3113 mutant leads to a lengthening of the period of locomotor activity, a defect of dentritic arborisation and a weakening of PER oscillations. UY3113 is located upside of a gene encoding a liprin-α1 which was confirmed to be overexpressed in the mutant by a quantitative PCR approach. An antibody against liprin-α1 allowed us to show the endogenous expression of liprin in the lateral neurons. In hypomorphic mutants, PDF accumulates in the cell bodies while it disappears from the axonal termini. Mutants overexpressing the liprin-α1 display an opposite phenotype, which suggests of role for the liprin in the axonal transport of PDF.