Développement d'outils génétiques et moléculaires pour l'étude des résistances aux antifongiques chez Candida lusitaniae : caractérisation d'une résistance croisée 5-fluorocytosine/fluconazole

Development of genetic and molecular tools for the study of antifungal resistance in Candida lusitaniae : caracterization of a 5-Fluorocytosine / Fluconazole cross-resistance mechanism

• Auteur / Autrice : Fabienne François, Jean-Louis Benoit-Guyod
• Direction : Jean Villard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Flucytosine

Fluconazole

Résistance aux antifongiques

Effets des fongicides

Candida lusitaniae

Résumé

L'émergence et le traitement des candidoses ont généré des problèmes de résistance aux antifongiques, thématique sur laquelle nous travaillons chez Candida lusitaniae. Cette levure pathogène opportuniste est en effet connue pour développer facilement des résistances aux antifongiques, et présente l'avantage d'être haploi͏̈de et de posséder un cycle sexuel. Avant d'en faire notre modèle d'étude il était nécessaire de développer des outils génétiques et moléculaires chez cette levure. La caractérisation du cycle sexuel de C. Lusitaniae chez 76 isolats d'une collection clinique, nous a permis d'en maîtriser les conditions d'obtention in vitro, de mettre au point une méthode d'isolement des ascospores pour réaliser des analyses génétiques, et de proposer un test d'identification alternatif de cette espèce, fondé sur sa capacité à se reproduire sexuellement. Par une technique d'amplification alliée à une marche chromosomique, nous avons ensuite cloné et séquencé le gène URA3 de C. Lusitaniae, codant pour l'orotidine 5'-phosphate decarboxylase, afin de l'utiliser comme marqueur génétique dans un système de transformation propre à cette espèce. Des mutants ura3 de C. Lusitaniae ont été transformés par électroporation avec des efficacités comparables à celles observées chez C. Albicans. Enfin, nous avons mis en évidence et caractérisé un phénotype original de résistance croisée vis-à-vis de l'association 5-fluorocytosine (5FC) / fluconazole (FCZ), chez des isolats cliniques de C. Lusitaniae 5FC-résistants et FCZ-sensibles. D'après les analyses génétiques, ce phénotype serait contrôlé par le seul gène de résistance à la 5FC. Les analyses cinétiques de transport de [14C]5FC ont montré un défaut d'entrée de la 5FC, liée à une déficience de la cytosine perméase, protéine codée par le gène FCY2. La résistance croisée pourrait alors s'expliquer par une inhibition compétitive du transport de FCZ par la 5FC. Cette hypothèse suppose l'existence d'un transport d'entrée de FCZ, ce qui n'a jamais été évoqué jusqu'à présent, et apporte des informations sur une nouvelle voie possible de résistance au FCZ par l'inhibition de son transport d'entrée chez les levures du genre Candida.

The increase of candidiasis in immunodefficient patients generates antifungal resistance problems among Candida species. We worked in this field with C. Lusitaniae, an opportunistic and pathogenic yeast known as easily developing resistance, and furthermore an avantageous haploid organism with a sexual cycle. Before its use as a model, the development of genetic and molecular tools was necessary. We first have determined the environmental conditions to trigger and complete the sexual cycle of all isolates in a collection of 76 clinical specimens. This led us to develop a method for isolating ascospores in order to perform genetic analysis and to propose an alternative identification test relying upon sexual reproductive ability. Using an amplification strategy combined to a chromosome walking, we have then cloned and sequenced the C. Lusitaniae URA3 gene, encoding orotidine 5'-phosphate decarboxylase, to use it as a selectable marker in a specific tranformation system. C. Lusitaniae ura3 mutants were succesfully electrotransformed with an efficiency comparable to that observed in C. Albicans. Finally, in the course of the study of C. Lusitaniae clinical isolates 5-fluorocytosine (5FC)-resistant and fluconazole (FCZ)-susceptible, we provided evidence and characterized an original cross-resistance phenotype appearing when 5FC / FCZ were used in association. According to genetic analysis, only the 5FC resistant gene would control this phenotype. Kinetic transport studies with [14C]5FC showed a defect of 5FC uptake related to a deficiency of the purine-cytosine permease, encoded by the FCY2 gene. Cross resistance could be the result of a competitive inhibition of FCZ uptake transport by extracellular 5FC. This hypothesis supports the occurrence of a FCZ uptake transporter, which has never been suggested thus far, and provides information on a new possible mechanism of resistance to FCZ, associated to an uptake deficiency of this drug, which can affect all species of the Candida genus.