Immobilisation d'objets biologiques sur des polymères type polypyrrole-biotine et détection par électrochimiluminescence pour l'élaboration de biopuces

Immobilisation of biological objects of polypyrrole-biotin polymers and detection by electroluminescence for elaboration of DNA chips

• Auteur / Autrice : Agnès Dupont Filliard
• Direction : Gérard Bidan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Électrochimie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015)

Résumé

L'objectif de ce travail est double, à savoir: (i) étudier un nouveau mode d'immobilisation de brins d'ADN (ODN) à la surface d'un polymère conducteur électronique via le système biologique biotine/avidine, et (ii) tester une nouvelle technique de détection pour l'hybridation de l'ADN basée sur l' électrochimiluminescence (ECL). La stratégie d'immobilisation consiste en l'électrosynthèse d'un film de polypyrrole fonctionnalisé par des molécules de biotine qui serviront ensuite de points d'ancrage pour les ODN sondes, eux-mêmes biotinylés, grâce au système '' sandwich'' biotine/avidine/biotine. Dans un premier temps, nous présentons la synthèse chimique de plusieurs monomères pyrrole-biotine, ainsi que la synthèse et la caractérisation électrochimique des différents polymères associés. La construction de l'assemblage moléculaire polypyrrole-biotine/avidine/ODN sondes a été ensuite suivie grâce à des mesures microgravimétriques. Enfin, nous avons démontré l'efficacité de ce mode d'ancrage envers l'hybridation d'un ODN cible complémentaire en solution, mais aussi la possibilité de réaliser un capteur à ADN régénérable grâce à la dénaturation du complexe biotine/avidine sans altérer les propriétés fonctionnelles de la couche biotinylée. Des tests de fluorescence ont été également entrepris pour confirmer les résultats gravi métriques après chaque hybridation. Dans un deuxième temps, nous avons prouvé que la détection de l 'hybridation par ECL est parfaitement adaptée à notre système, car il est possible de lire ce phénomène à l'interface d'un film de polypyrrole grâce à l'ancrage sur l'ODN cible hybridé d'un marqueur ECL adapté, le luminophore luminol. Cette technique de détection optique a permis d'obtenir une réponse sensible et quantitative. Appliquée aux biopuces, elle ouvre donc la perspective de mesures quantitatives de l'hybridation, contrairement à la détection par fluorescence, tout en conservant la sensibilité des détecteurs optiques.

The objectives of this work are : (i) investigation of a new mode of immobilization for DNA strands (ODN) at the surface of a conducting polymer using a biotinlavidin system, (ii) testing of a new detection method based on electrochemiluminescence (ECL) for detecting DNA hybridization at the sensor surface. Immobilization protocol consists in electrosynthesis of a polypyrrole film functionalized with biotin molecules. These biotin molecules in-tum serve as anchor points for biotinylated ODN probes through a biotin/avidin/biotin sandwich. In a first part, we describe the chemical synthesis of several pyrrole/biotin monomers as weIl as synthesis and electrochemical characterization of the various associated polymers. Construction of the polypyrrole-biotin/avidin/ODN probe molecular assembly has been followed using microgravimetric measurements. We have first demonstrated the efficiency of this anchoring mode versus the hybridization of a complementary ODN target in solution, then the possibility to construct a recyclable DNA sensor thanks to the denaturation of the biotinlavidin complex with no alteration of the functional properties of probe the biotinylated layer. Fluorescence tests have been designed to confirm the gravimetric results after each hybridization. In a second part, we have proved that detection of hybridization by ECL is perfectly adapted to this sensor system. Indeed it is possible to reveal the events at the polypyrrole film interface by grafting the luminophore luminol, an ECL marker, on the target ODN. This optical detection method has allowed the development of a sensitive and quantitative response. Applied to biosensors this method opens the possibility of quantitative hybridization measurements as opposed to fluorescence detection, with however keeping the sensitivity of optical methods.