Glycosyl hydrolases impliquées dans des maladies lysosomales : Analyses de mutations du site actif basées sur des prédiction structurales

Glycosyl hydrolases implicated in lysosomal diseases : structural features and mutagenesis studies of their active site

• Auteur / Autrice : Sylvie Fabrega
• Direction : Jehan-François Desjeux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2002
• Etablissement(s) : Paris, CNAM

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sites actifs (biochimie)

Analyse enzymatique

Maladies lysosomiales congénitales

Glycosidases

Glucocérébrosidase

Résumé

Des glycoside hydrolases (EC. 3. 2. 1. X) (GH) lysosomales dont la fonction consiste en l'hydrolyse de composés glycosylés cellulaires sont impliquées dans des maladies génétiques humaines regroupées sous le terme de ''maladies lysosomales''. Nous avons effectué des études structurales et fonctionnelles sur certaines de ces GH lysosomales afin de mieux comprendre la physiopathologie des maladies de surcharge métabolique très invalidantes les impliquants. Une vaste étude sur différentes GH, utilisant un même mécanisme catalytique (rétention de la configuration anomérique), incluant des GH lysosomales, a été menée en collaboration avec des spécialistes de modélisation moléculaire. L'analyse de la séquence primaire des protéines par la méthode HCA (Hydrophobic Cluster Analysis) de prédiction 2D, et l'exploitation des banques de donnnées sur des GH cristallisées, ont conduit à la proposition d'un modèle structural de type tonneau (α/ß)8, commun à toutes les enzymes dans le clan des brins ß4 et ß7 du tonneau ont été localisés. Les éléments structuraux et fonctionnels du site catalytique de cinq GH lysosomales : la glucocérébrosidase (maladie de gaucher), l'α-L-iduronidase (mucopolysacharidose de type I), la ß-galactosidase (ganglyosidose GM1), la ß-glucuronidase (syndrome de Sly) et a ß-mannosidase (ß-mannosidose) ont été caractérisés. L'impact structural et fonctionnel de mutations génétiques a été analysé. Nous avons ensuite exploité les prédictions de modélisation effectuées sur ces enzymes pour mieux caractériser les acides aminés, catalyseurs acide-bases et nucléophile, de la glucocérébrosidase et l'α-L-iduronidase humaine ; des protéines pour lesquelles une thérapie enzymatique est développée. A l'aide d'une stratégie de biologie cellulaire basée sur une mutagénèse substitutive des acides aminés suspectés et une expression des protéines recombinantes, mutées et non mutées, dans un système cellulaire hétérologue, nous avons obtenu une invalidation totale de l'activité catalytique des enzymes. Nous avons montré que la perte d'activité n'était pas liée à un défaut de biosynthèse et de maturation des protéines mutées, mais des mutations introduites. Aussi, nous avons été en mesure d'impliquer très fortement les acides glutamiques 235 et 340 de glucocérébrosidase et les acides glutamiques 182 et 299 de l'α-L-iduronidase dans la fonction catalytique de ces GH. Nous avons ainsi apporté une validation expérimentale à nos prédictions. L'ensemble de nos travaux de modélisation moléculaire et d'analyse de relation structure-fonction souligne ici l'importance d'une complémentarité entre les approches de prédictions de structure et les approches de vérifications expérimentales pour la connaissance du fonctionnement catalytique de GH lysosomales impliquées dans des maladies génétiques.

Glycosyl hydrolases (GH) are a widespread group of enzymes. Several lysosomal strorage diseases characterized by a severe handicap are due to deficiences in GH. A structural biology study concerning the numerous enzymes belonging to clan GH-A of GH was performed. Clan GH-A includes 5 human enzymes implicated in lysosomal diseases : glucocerebrosidase, α-L-iduronidase, ß-galactosidase, ß-glucuronisade and ß-mannosidase. Predictions concerning the active site structure of these enzymes were made by Hydrophobic Cluster Analysis (HCA), a bidimensional analytical method permitting to compare highly divergent protein sequences. We found that all the active sites may have a similar 3D structures consisting af an (α/β)8 barrel. In particular, a pair of glutamic acid residues, presumed to directly participate in the enzymatic hydrolysis, was identified. Finally, analysis of mutations described in patients was in agreement with the predictions. Next, we performed site-directed mutagenesis studies to obtain experimental evidence supporting our HCA predictions. These studies concerned the glutamatic acid residues supposed to be involved in the catalytic activity of glucocerebrosidase and α-L-iduronidase. Substitution of these glutamatic acids by alanine residues led to complete inactivity of the mutant proteins without affecting their folding/processing. These data further support that Glu235/Glu340 and Glu182/Glu299 play a key role in th enzymatic activity of glucocerebrosidase and α-L-iduronidase, respectively. In conclusion, our work shows that strutural biology and mutagenesis studies may be highly complementary for a better understanding of the structure/function relationship in enzymes involved in severe genetic diseases.