Analyse fonctionnelle du promoteur du gène codant le recepteur du GnRH de rat

par Hanna Pincas

Thèse de doctorat en Signalisation cellulaire, endocrinologie et reproduction

Sous la direction de Raymond Counis.

Soutenue en 2001

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) (autre partenaire) .

Le président du jury était Micheline Misrahi.

Le jury était composé de Micheline Misrahi, Danielle Gourdji, Michel Raymondjean, Claude Kordon, Jean-Noël Laverrière.

Les rapporteurs étaient Danielle Gourdji, Michel Raymondjean.


  • Résumé

    Le GnRH, un neuropeptide hypothalamique, interagit avec son récepteur antéhypophysaire, le R-GnRH, pour stimuler la synthèse et la sécrétion des gonadotrophines LH et FSH, qui régulent fonction gonadique. Plusieurs hormones, dont le GnRH, modulent le niveau d'expression du gène du R-GnRH. Afin d'élucider les bases moléculaires de la régulation transcriptionnelle de ce gène, nous avons cloné chez le rat 3,3 kb de sa région 5'-flanquante, puis localisé les sites d'initiation de transcription hypophysaires. Les expériences de transfection transitoire dans les lignées gonadotropes αT3-1 et Lβ3T2 démontrent l'existence d'un enhancer distal (GnSE) induisant une activité maximale uniquement dans contexte du promoteur proximal de 500 pb. De nouvelles analyses, complétées par des expériences gel-retard, ont révélé que le GnSE comporte 2 éléments actifs qui lient respectivement des facteurs apparentés à LIM et GATA, et que son activité est relayée par une séquence proximale restreinte à 50 pb, incluant un site SF-1 fonctionnel. Nous avons également démontré l'activation via la voie dépendante de l'AMPc du promoteur du R-GnRH par le PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide), un peptide hypophysiotrope. En attestent les effets mimétiques des activateurs de cette voie, ainsi que l'inhibition de cette stimulation par sur-expression du PKI, un inhibiteur de la PKA. L'élément de réponse au PACAP est bipartite, avec une première région (PARE 1), comprenant SF-1, et une deuxième (PARE II) liant une protéine de type CREB (CRE-binding protein). Des facteurs inconnus se lient aussi à PARE I et semblent interagir avec la protéine SF-1. Nos travaux établissent le rôle substantiel de SF-1, à la fois dans l'expression constitutive du gène R-GnRH en tant que médiateur d'une activité enhancer, et dans sa régulation par le PACAP via la voie des PKA. L'approche par transgénèse initiée au laboratoire devra permettre de suivre son expression hypophysaire ou non, au cours du développement et dans des situations physiologiques déterminantes.

  • Titre traduit

    Functional analysis of the rat GnRH receptor gene promoter


  • Résumé

    The hypothalamic GnRH, by acting through a specifie membrane receptor, stimulates the synthesis and release of gonadotropins LH and FSH, which regulate gonadal function. Several hormonal factors, including GnRH, modulate the level of GnRH-R gene expression. To investigate this issue at the transcriptionallevel, we isolated a large fragment (3. 3 kb) of its 5'-flanking region, and identified 5 major transcription start sites in the pituitary. Transient transfection experiments in the gonadotrope-derived aT3-1 and LBT2 cell lines demonstrated the existence of a distal enhancer (GnSE) that is highly active in the context of the GnRH-R gene proximal promoter. We showed that the GnSE activity is mediated through a functional interaction with a proximal 50 hp-region that includes an SF-1 binding site, and identified the GnSE active elements within 2 sequences. Gel-shift assays indicate that the SF-1 motif is functional, and that GnSE response elements interact with GATA- and LIM­ related factors, respectively. Moreover, we provided the first evidence that the hypophysiotropic factor PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide) stimulates GnRH-R promoter activity through the mediation of PKA-signaling pathway. Similar results were indeed obtained following treatments with adenylate cyclase activators, whereas the surexpression of a PKA inhibitor (PKI) markedly reduced this stimulation. PACAP activation relies on a bipartite response element that consists of a first region (PARE 1), which includes the SF-1 site, and a second region (PARE II), which binds a CREB-related protein. Potential SF-1-interacting factors also bind to PARE 1. These data reveal a novel role for SF-1 as a mediator of enhancer activity, and its involvement in the hormonal regulation of the GnRH-R gene by PACAP through he PKA-mediated pathway. Transgenic mice have been recently generated in our laboratory to allow the study of GnRH-R gene expression during development (including in nonpituitary tissues), estrous cycle and puberty. This approach will deepen our knowledge about its physiological role.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (177 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p.138-176

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  • Bibliothèque : Université Paris-Saclay (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne). DIBISO. BU Médecine.
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  • Cote : TD/2001T047
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
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  • Cote : MFTH 4579

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  • Cote : 2001PA11T047
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