Etude de l'implication de l'hélicase BLM, altérée dans le syndrome de Bloom, dans les voies de réponse cellulaires induites par des stress génotoxiques

Study of the Bloom syndrome associated helicase BLM in genotoxic stress-induced cell response pathways

• Auteur / Autrice : Mouna Ababou
• Direction : Mounira Amor-Guéret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Paris 11

Mots clés

Mots clés libres

Instabilité génétique

Prédisposition tumorale

Recombinaison homologue

Apoptose

Résumé

Le syndrome de Bloom (SB) est une maladie génétique autosomique récessive rare caractérisée principalement par une prédisposition au développement de tous les types de cancers affectant la population générale et une instabilité génétique généralisée. Le gène BLM, dont les mutations sont à l'origine de ce syndrome, code pour une protéine appartenant à la sous-famille des hélicases RecQ et qui possède une activité 3'-5' ADN hélicase dépendante de l'ATP. Le rôle physiologique de la protéine BLM est encore très peu connu à ce jour et son identification constitue la priorité de notre laboratoire. Les anomalies cellulaires et cliniques associées au syndrome de Bloom, et l'appartenance de la protéine BLM à la famille des hélicases RecQ, nous ont naturellement orientés vers une implication de la protéine BLM dans un mécanisme de maintien de la stabilité du génome. Les travaux présentés dans ce manuscrit montrent que l'expression de la protéine BLM endogène est régulée au cours du cycle cellulaire et qu'elle s'accumule et se phosphoryle en réponse aux radiations ionisantes (RI) par une voie dépendante de la présence d'une protéine kinase ATM fonctionnelle. Nous montrons également que cette protéine est phosphorylée en réponse à un traitement par un inhibiteur de la réplication (HU) ainsi qu'aux rayonnements ultraviolets (UVC) par une voie indépendante de la kinase ATM. Par ailleurs, nous observons dans les cellules SB traitées aux RI ou aux UVC présentent un défaut partiel du point de contrôle G2/M ainsi que des anomalies de réponse des protéine p53 et p21^(CIP1/WAF1) en réponse aux UVC. Nous montrons également que la protéine BLM est clivée au cours de l'apoptose induite aussi bien par un traitement aux UVC qu'à l'HU, et qu'une lignée SB n'exprimant pas de protéine BLM est résistante à l'apoptose UVC-induite, alors qu'une lignée SB exprimant une protéine BLM entière mais non fonctionnelle présente une sensibilité normale à ce type d'apoptose. En revanche, ces deux lignées présentent la même résistance à l'apoptose induite par l'HU. L'ensemble de nos résultats sont en faveur de l'implication de la protéine BLM dans différents mécanismes assurant le maintien de l'intégrité du génome en réponse à différents stress génotoxiques, tels que la réparation des cassures double-brin de l'ADN, le point de contrôle G2/M du cycle cellulaire et l'induction de l'apoptose.

Bloom's syndrome (BS) is a rare human autosomal recessive disorder characterized by an increased risk to develop cancer of all types. BS cells are characterized by a generalized genetic instability including a high level of sister chromatid exchanges. BS arises through mutations in both alleles of the BLM gene which encodes a 3'-5' DNA helicase identified as a member of the RecQ family. We showed that BLM protein expression is regulated during the cell cycle, accumulating to high levels in S phase, persisting in G2/M and sharply declining in G1, suggesting a possible implication of BLM in a replication (S phase) and/or post-replication (G2 phase) process. On the other hand, we showed that, in response to ionizing radiation, BLM-deficient cells exhibit a normal p53 response as well as an intact GUS cell cycle checkpoint, which indicates that ATM and p53 pathways are functional in BS cells. We also show that the BLM defect is associated with a partial escape of cells from the g-irradiation-induced G2/M cell cycle checkpoint. Finally, we present data demonstrating that, in response to ionizing radiation, BLM protein is phosphorylated and accumulates through an ATM-dependent pathway. Altogether, our data indicate that BLM participates in the cellular response to ionizing radiation by acting as an ATM kinase downstream effector. We also show that following UVC treatment, BLM-deficient cells exhibit a reduction in the number of replicative cells, a partial escape from the G2/M cell cycle checkpoint, and have an altered p21 response. Surprisingly, we found that hydroxyurea-treated BLM-deficient cells exhibit an intact S-phase arrest, proper recovery from the S phase arrest, and intact p53 and p21 responses. We also show that the level of BLM falls sharply in response to UVC radiation. This UVC-induced reduction in BLM does not require a functional ATM gene and does not result from a sub-cellular compartment change. Finally, we demonstrate that exposure to UVC and hydroxyurea treatment both induce BLM phosphorylation via an ATM-independent pathway. Furthermore, we report the cleavage of the Bloom's syndrome protein (BLM) in hydroxyurea (HU)- or UVC-induced apoptosis. Appearance and solubility of BLM proteolytic products differed whether proteolysis occurred in response to HU or UVC. One BS cell line homozygous for a null mutation in BLM was found resistant to both UVC- and HU-induced apoptosis. Another one expressing a mutated BLM protein resisted HU-induced apoptosis, but displayed a normal sensitivity to UVC. Thus, UVC and HU appear to induce apoptosis through distinct pathways.