Adaptation des proprietes de la phosphatase alcaline d'escherichia coli au marquage enzymatique et ses applications biotechnologiques

• Auteur / Autrice : BRUNO MULLER
• Direction : JEAN-CLAUDE BOULAIN
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

L'objectif de ce travail consiste en la mise au point d'une strategie d'evolution dirigee permettant l'adaptation des proprietes de la phosphatase alcaline d'escherichia coli (phoa) au marquage enzymatique. En terme de marquage enzymatique, la phosphatase alcaline extraite d'intestin de veau (cip) constitue l'une des enzymes de reference. Elle presente 30% de residus communs avec phoa et se caracterise par une activite 40 fois plus elevee. Neanmoins la phoa est nettement plus thermostable (t m = 95\c contre t m = 67\c pour la cip). Notre travail d'ingenierie a consiste a ameliorer l'activite catalytique de l'enzyme bacterienne, tout en preservant sa thermostabilite. La premiere partie decrit l'etat de l'art concernant les differentes strategies d'ingenierie de proteines, en orientant l'analyse sur les proteines catalytiques. La deuxieme partie concerne la description et la discussion de la strategie originale qui nous a permis d'obtenir le mutant phoa d153g/d330n. Celui-ci ne differe de l'enzyme bacterienne sauvage que par deux residus, dont un est situe a l'exterieur du site actif (330). Neanmoins il presente des proprietes (activation par le magnesium, k c a t, k m et ph optimum) tres similaires a la cip. De plus, il est parfaitement stable (t m = 87\c et conservation > 1 an). Par rapport a la cip, le double mutant phoa d153g/d330n presente l'avantage de pouvoir etre fusionne genetiquement a un autre partenaire proteique. La troisieme partie fait le point sur les vecteurs de fusion, comportant le gene codant pour le double mutant, qui permettent une production homogene, simple, rapide et reproductible de traceurs immuno-enzymatiques recombinants. L'utilisation des vecteurs de fusion en tant que nouvel outil de laboratoire pour de nombreuses applications, telles que l'elisa, les immuno-blots (southern-, northern-, ou western-blot), la cartographie d'epitope ou de paratope, ou l'etude d'interactions proteine-proteine, est decrite.