Phosphorylation des analogues de nucleotides antiretroviraux par la nucleoside diphosphate kinase

• Auteur / Autrice : Benoît Schneider
• Direction : Dominique Deville-Bonne
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences médicales
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

Les analogues de nucleotides administres dans les therapies antiretrovirales (ddn, azt, d4t, 3tc) sont transformes dans la cellule en triphosphate par des kinases cellulaires avant d'atteindre leur cible, la transcriptase inverse du virus vih. Cette activation implique les enzymes de la voie de recuperation des nucleotides. Le dernier phosphate est ajoute par la nucleoside diphosphate (ndp) kinase, veritable enzyme de menage, avec une specificite large pour tous les nucleotides. La reactivite de la ndp kinase avec les analogues antiretroviraux s'est averee beaucoup plus faible que supposee. A l'aide d'une methode mesurant la fluorescence intrinseque de la proteine, nous avons etudie la reactivite de l'enzyme avec differents analogues de nucleotides donneur (ntp) ou accepteur (ndp) de phosphate. Bien que l'equilibre de la reaction avec les ntp et ndp soit le meme que pour les nucleotides naturels, la vitesse de transfert de phosphate est tres diminuee (1000 a 10000 fois) pour les analogues antiviraux, substrats lents de la ndp kinase. L'affinite relative des ntp a ete mesuree directement pour un mutant inactif de l'enzyme. Tous les antiviraux se lient moins bien au site actif que leurs homologues naturels a l'exception du d4t triphosphate qui se lie a l'enzyme avec la meme affinite que la thymidine triphosphate. L'absence de 3'oh sur le ribose empeche l'etablissement d'une liaison hydrogene intramoleculaire avec l'o 7 du phosphate , cruciale pour une catalyse efficace. Seul le d4t est capable d'effectuer partiellement une interaction de ce type. C'est le meilleur antiviral phosphoryle par la ndp kinase. L'examen de la structure d'un nucleotide lie au site actif montre que l'oxygene pro-rp du phosphate du nucleotide n'interagit ni avec le mg 2 +, ni avec la proteine. En collaboration avec l'unite de chimie organique de l'institut pasteur, un groupement borano (-bh 3) a ete introduit a la place de cet oxygene. Les derives rp--bh 3 de l'azt et du d4t di- et triphosphate sont dix fois mieux phosphoryles par la ndp kinase, en raison de leur meilleure affinite pour l'enzyme. Le diastereoisomere rp est aussi un meilleur terminateur de chaine de l'activite transcriptase inverse : les nucleotides -borano sont plus efficacement incorpores dans l'adn viral. Ils sont egalement moins sensibles a l'excision (pyrophosphorolyse) par l'enzyme sauvage comme par des variants resistants de la polymerase virale. A cause du role essentiel de la fonction 3'oh du nucleotide, nous avons essaye de compenser son absence dans les analogues antiviraux en introduisant une fonction - oh dans le site actif de la ndp kinase. Plusieurs mutants ont ete crees par mutagenese dirigee : un seul mutant pour lequel l'asn 119 a ete substituee par une ser phosphoryle mieux les antiviraux avec une efficacite catalytique entre deux et dix fois superieure, due a une fixation plus aisee au site actif. L'introduction de la ser en 119 permet de restaurer le reseau de liaisons hydrogene indispensable au transfert de phosphate. En parallele, nous avons recherche de nouveaux inhibiteurs de la ndp kinase : l'adenosine 3 phosphate 5 phosphosulfate (paps) inhibe l'activite ndp kinase avec une affinite de 10 m. L'analyse des cocristaux de l'enzyme complexee avec le paps montre que l'analogue de nucleotide se lie au site actif selon un mode different du nucleotide naturel. Le paps represente ainsi l'inhibiteur de plus forte affinite connu pour cette enzyme.