Synthèse et études spectroscopiques d'oligonucléotides liés à un marqueur fluorescent, le Thiazole orange

Synthesis and spectroscopic studies of oligonucleotides linked to a fluorescent label : the thiazole orange

• Auteur / Autrice : Eric Privat
• Direction : Ulysse Asseline
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie et physicochimie des composés d'intérêt biologique
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Orléans

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN messagers

Oligonucléotides

Résumé

Ce travail a consisté en la synthèse et l'étude d'oligo-2'-désoxyribonucléotides couplés à une molécule fluorescente, le Thiazole-Orange (TO). Actuellement, il existe peu de méthodes permettant la détection directe des ARN messagers (ARNm) dans les cellules vivantes. Le Thiazole-Orange est une molécule très faiblement fluorescente en solution aqueuse mais dont la fluorescence est fortement augmentée en présence d'ADN double brin. Le TO s'intercale ou interagit dans le petit sillon de la double hélice d'ADN. Les conjugués oligonucléotide-TO constituent donc des outils potentiels attractifs pour la détection de l'ARNm dans des cellules vivantes. En effet, la sonde devrait produire une augmentation de fluorescence et/ou un décalage spectral lorsque le TO interagit avec la double hélice formée, témoignant de l'hybridation de la sonde avec sa séquence cible. Différents conjugués ont été préparés: des pentadeca-2'-désoxyriboadénylates et des icosa-?-thymidylates (résistants aux nucléases) pour les études dans les cellules. L'influence de la nature du bras et de l'isomérie du phosphate (portant le marqueur) sur les propriétés spectroscopiques des sondes seules ou en présence des séquences cibles a été étudiée par spectroscopies d'absorption et de fluorescence à l'état stationnaire et résolue en temps (LURE, Orsay, France). Les résultats des études réalisées avec les différents conjugués montrent que la présence du TO stabilise les duplex formés à partir des pentadeca-2'-désoxyriboadénylates mais pas ceux obtenus à partir des dérivés icosa-?-thymidylates et que dans tous les cas une augmentation du rendement quantique de fluorescence des conjugués est observée lors de l'hybridation. Des études de détection des ARNm, après pénétration dans les cellules vivantes (par incubation ou microinjection) des sondes liées au TO et résistantes aux nucléases ont permis d'obtenir une carte de leur distribution intracellulaire.