Caractérisation pharmacologique, biochimique et moléculaire d'une protéine liant la proctoline : récepteur ou enzyme ?

• Auteur / Autrice : Claire Mazzocco
• Direction : Jacques Puiroux
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacie. Neurosciences et neuropharmacologie
• Date : Soutenance en 2001
• Etablissement(s) : Bordeaux 1

Mots clés

Mots clés contrôlés

Drosophiles

Dipeptidylpeptidase III

Neuropeptides

Insectes

Résumé

La proctoline, premier neuropeptide purifié chez l'insecte est connu pour son action myotrope sur les muscles squelettiques et viscéraux. En test biologique de contractions d'intestins de blatte, la proctoline agit à une EC50 de 1nM. Des études de liaison avec la proctoline tritiée ont permis de préciser les caractéristiques pharmacologiques (Kd=100nM et Bmax=2,5 pmoles/mg de protéines) des récepteurs potentiels sur les intestins. La nature des seconds messagers impliqués correspond à une production d'IP3 et de DG. Après cinq étapes de séparation par chromatographie, deux bandes de 76 et 80 kDa ont été obtenues en électrophorèse. Après le séquençage partiel des deux bandes et la recherche dans les banques de données, une protéine de drosophile de 723 acides aminés (82 kDa) présentant 50% d'identité avec la DPP III de rat a été déduite. Des anticorps anti-DPP III ont permis par Western blot de confirmer la nature de la protéine purifiée (DPP d'insecte). Les caractéristiques enzymatiques de la DPP de blatte ont été définies pour la proctoline (Km=3,78uM ; Vmax=1,107 umoles/mg/min. ). La tyn rphine (Ki=75nM), inhibiteur de la DPP III de vertébrés,inhibe la dégradation de la proctoline. Des tests biologiques ont révélé un accroissement des contractions induites par la proctoline en présence d'anticorps anti-DPP III (de 25% à 70%) ou de tynorphine (de 20% à 45%). La présence de la DPP chez la drosophile a été vérifiée par purification chromatographique, PAGE et électrotransfert. Deux bandes protéiques de 82 et 86 kDa furent identifiées par les anticorps anti-DPP III. Deux bandes similaires étaient visualisées après surexpression en système cellulaire S2 d'un clone cDNA de drosophile codant pour la protéine de 723 acides aminés. La DPP III-like purifiée à partir de drosophiles ou après surexpression présente les caractéristiques enzymatiques spécifique de la DPP III de vertébrés, confirmant ainsi l'existence de cette enzyme chez les insectes.