Thèse soutenue

Outils chimiques et méthodologies d'analyse des radicaux superoxyde et monoxyde d'azote : étude par RPE de la régulation du stress oxydant dans la paroi artérielle

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Auteur / Autrice : Marie-Aline Barbacanne
Direction : Françoise Nepveu
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Physique - chimie d'intérêt biologique
Date : Soutenance en 2000
Etablissement(s) : Toulouse 3

Résumé

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L'objectif de ce memoire a ete d'etudier le role des radicaux oxygenes, monoxyde d'azote (no) et anion superoxyde (o 2 ), dans les processus redox cellulaires. Les methodologies utilisees ont ete basees principalement sur la resonance paramagnetique electronique (rpe) et le piegeage de spin. Des ligands organiques ont ete synthetises, caracterises puis appliques a la complexation du fer(ii) pour developper des piegeurs de spin specifiques de no. Leurs proprietes ont ete etudiees en milieu aqueux et ont permis de retenir les piegeurs les mieux adaptes pour l'etude des mecanismes de regulation de no sur des modeles biologiques. Un milieu minimum de survie cellulaire et les conditions de detection ont ete optimises pour detecter o 2 et no liberes par des cellules endotheliales en culture. Les piegeurs synthetises n'ont pas permis la detection de no. Par contre, la production de o 2 est maximale a postconfluence. Les performances de 3 techniques (absorption uv-visible et cytochrome c, fluorescence et hydroethidine, chimioluminescence et lucigenine) ont ete comparees a celles de la rpe pour la detection de o 2 libere par les cellules endotheliales. Cette etude a revele des artefacts et des problemes methodologiques relatifs a la sensibilite et la specificite des sondes pour 2 techniques : la detection de o 2 par spectrophotometrie uv-visible n'a pu etre observee que pour une concentration de 20 m en cytochrome c ; la lucigenine est une source artefactuelle de o 2 et ne devrait plus etre utilisee pour detecter et quantifier o 2 par chimioluminescence. Dans la paroi arterielle, l'endothelium est responsable de l'essentiel de la production extracellulaire de o 2 qui semble generee par une nad(p)h oxydase membranaire regulee par une proteine kinase c, independamment de la liberation concomitante de no. La methodologie rpe a contribue a montrer que l'oestradiol augmente la quantite de no, sans modifier sa production, en diminuant la production endotheliale extracellulaire de o 2.