Utilisation des nucleosides pyrimidiques dans le salvage pathway de saccharomyces cerevisiae. Clonage, caracterisation, et expression des genes cdd1 et urh1 codant pour la cytidine desaminase et l'uridine ribohydrolase

• Auteur / Autrice : JEAN-EMMANUEL KURTZ
• Direction : RICHARD JUND
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008)

Résumé

Dans la levure saccharomyces cerevisiae, le salvage pathway des pyrimidines permet l'utilisation de bases et de nucleosides exogenes en tant que source d'ump, precurseur obligatoire de toutes les pyrimidines presentes dans les acides nucleiques. Meme dans une souche possedant une voie de biosynthese de novo des pyrimidines fonctionnelle, l'utilisation des pyrimidines exogenes est privilegiee. Nous avons clone et sequence le gene cdd1, codant pour la cytidine desaminase, par amplification d'une sequence putative du genome de s. Cerevisiae, portant la sequence signature de la famille des desaminases. Le gene a ete egalement interrompu par recombinaison avec un plasmide pfl35 portant une sequence incomplete de cdd1. Nous avons pu montrer que l'uridine kinase, qui transforme l'uridine en ump etait egalement capable de phosphoryler la cytidine. Dans le salvage pathway, l'uridine est transformee en uracile plus ribose par une uridine ribohydrolase. Nous avons clone et sequence le gene urh1 codant pour cette enzyme, et precise les caracteristiques de la proteine vis-a-vis de plusieurs substrats. L'analyse de la sequence de urh1 a montre l'existence de deux sites d'initiation de la traduction, dont nous avons montre que seul le second etait fonctionnel. Le gene urh1 a ete interrompu par une methode similaire a celle que nous avons appliquee a urh1. A l'aide de la technique de gap repair, nous avons clone et sequence le mutant urh1-2, mettant en evidence une mutation non-sens e 2 5 3 to stop. L'application des techniques de genetique classique nous a permis de construire plusieurs souches recombinant les genes du salvage pathway des pyrimidines. Nous avons pu definir les phenotypes correspondants, et les relier a des modifications de flux metaboliques. Enfin, la comparaison du salvage pathway de s. Cerevisiae a sa contrepartie dans divers organismes parasitaires et chez l'homme nous a permis d'une part de montrer son importance dans le developpement de nouvelles strategies de lutte antiparasitaire et de traitements anticancereux bases sur les nouveaux analogues des pyrimidines, et d'autre part d'envisager des perspectives prometteuses de therapie genique.