Voie de signalisation MAP kinase/ERK et second messager AMPc dans le système nerveux : contribution de la régulation de la protéine B-Raf par la PKA

• Auteur / Autrice : Sandra König
• Direction : Jean-Vianney Barnier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurologie
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 11
• Jury : Président / Présidente : Claude Kordon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claude Kordon, Jean-Antoine Girault, Gilles Pagès, Jocelyne Caboche
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean-Antoine Girault, Gilles Pagès

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines proto-oncogènes B-raf

Protéines et peptides de signalisation intracellulaire

Phosphorylation

MAP kinase

AMP cyclique

Neurophysiologie

Résumé

Les protéines B-Raf, Raf-1 et A-Raf forment une famille de sérine/thréonine kinases cytoplasmiques, éléments centraux d'une voie de signalisation intracellulaire aboutissant à la régulation des protéines MAP kinases de la sous-famille ERK. Contrairement à Raf-1 qui est exprimée de manière ubiquiste chez la souris adulte, les protéines B-Raf et A-Raf présentent des profils d'expression plus restreints, en particulier aux systèmes nerveux et urogénitaux respectivement. Si les protéines Raf-1 et B-Raf sont exprimées dans les mêmes aires du cerveau, elles peuvent présenter des localisations subcellulaires différentes. Bien que fortement conservées les protéines B-Raf et Raf-1 peuvent intégrer des signaux initiés par les stimuli extracellulaires de manière différente, possédant ainsi la capacité de réguler différentiellement l'activité des protéines ERK. En particulier, cette spécificité des protéines Raf semble rendre compte des effets contradictoires du second messager AMPc notamment sur la croissance, la différenciation et la survie de différents types cellulaires. Il a été montré que l'inhibition des protéines MAPK/ ERK1/2 observée en réponse à l'augmentation du taux intracellulaire d'AMPc résulte de l'inhibition de la protéine Raf-1. Elle-même consécutive à la phosphorylation de la kinase par la PKA. Dans les neurones et certaines lignées neuronales (PC12, CATH. A), ce second messager entraîne au contraire la stimulation de la voie de signalisation, qui dépend alors de l'activation de la protéine B-Raf. L'hypothèse à l'origine de ce travail de thèse prévoyait que la phosphorylation des isoenzymes Raf par la PKA puisse permettre la régulation différentielle des protéines ERK1/2 en réponse à l'augmentation du taux intracellulaire d'AMPc. Nous avons vérifié que la protéine B-Raf pouvait être directement phosphorylée par la PKA, avant d'entreprendre l'identification de différents sites de phosphorylation. L'établissement de cartes phosphopeptidiques bidimensionnelles de la protéine phosphorylée in vitro par la PKA nous a permis de conclure à la présence de cinq sites de phosphorylation. La nature des résidus phosphorylés a été proposée grâce à l'identification de motifs consensus de phosphorylation par la PKA. La mutagénèse dirigée de ces résidus nous a permis de montrer que la PKA phosphoryle la protéine B-Raf sur quatre résidus sérine en positions équivalentes à des sites régulateurs de Raf-1 préalablement décrits, ainsi que sur un site spécifique de l'isoenzyme (sérine 429). L'augmentation du taux intracellulaire d'AMPc dans les cellules PC12 (phéochromocytome de rat) et CATH. A (tumeur du cerveau de souris) induit essentiellement la phosphorylation de ce dernier site. L'analyse des conséquences de la mutation de ce site nous a permis de conclure que la phosphorylation de la sérine 429 a un effet inhibiteur sur l’activité des protéines ERK1/2. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de la protéine B-Raf par la PKA ne contribue pas à la simulation de la voie de signalisation, mais participe plutôt à l’atténuation du signal en réponse à des simulations qui perdurent.