Une nouvelle protéine découplant mitochondriale UCP2 : le gène, la protéine et ses rôles physiologiques

• Auteur / Autrice : Claire Pecqueur-Hellman
• Direction : Daniel Ricquier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Endocrinologie et interactions cellulaires
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 11
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université de Paris-Sud. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Jury : Président / Présidente : Anne Guiochon-Mantel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne Guiochon-Mantel, Michel Raymondjean, Gérard Brandolin, Hervé Vidal
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Michel Raymondjean, Gérard Brandolin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Macrophages

Espèces réactives de l'oxygène

Gènes de mitochondrie

Protéine-2 de découplage

Souris de laboratoire

Poumon

Stress oxydatif

Cellules -- Interaction

Mots clés libres

Mitochondries

Résumé

La protéine découplante UCP2 est une protéine mitochondriale exprimée dans de nombreux tissus. Les variations du niveau d'expression de l'ARNm UCP2 observées dans certaines situations physiologiques suggéraient l'existence d'une régulation transcriptionnelle. Le clonage du gène humain a permis de mettre en évidence un promoteur riche en bases GC, ne comportant ni boîte TATA, ni boîte CAAT. Des transfections transitoires dans une lignée d'adipocytes bruns avec des constructions CAT ont permis de mettre en évidence une activité promotrice relativement forte. La mise en évidence d'une ORF1 dans la région 5' non codante a remis en cause la traduction de la phase de lecture codant la protéine UCP2. Cependant, cette ORFl n'a aucun effet sur l'efficacité de traduction de la protéine UCP2 dans des lysats de réticulocytes. Ces résultats n'ont pas pu être confirmés in vivo étant donné les résultats peu convaincants obtenus avec les anticorps anti-UCP2 disponibles à l'époque. La caractérisation de ces anticorps a constitué la première étape de l'étude immunologique de la protéine UCP2. L'immunoprécipitation des protéines mitochondriales détectées par les anticorps n'a pas permis leur identification. Cependant, l'invalidation du gène Ucp2, réalisée en parallèle, a fourni d'excellents témoins négatifs. Aucun des anticorps disponibles ne s'est avéré capable de détecter la protéine in vivo. Ces résultats incitèrent le laboratoire à produire un anticorps dirigé contre la protéine entière susceptible d'être plus sensible. La purification de la protéine puis l'obtention d'anticorps très sensible révéla la présence de la protéine dans la rate, le poumon, l'estomac et le tissu adipeux blanc. Cet anticorps a aussi permis de montrer une induction de l'expression de la protéine UCP2 dans les mitochondries d'estomac de souris à jeûn et dans les mitochondries de poumon de souris injectées au LPS. De manière surprenante, les variations d'expression de la protéine ne sont pas corrélées à des variations d'expression de l'ARNm. Des transfections transitoires dans des cellules COS ont montré que la traductibilité de la protéine UCP2 est nettement favorisée en absence de l'ORFl. Parallèlement, les souris Ucp2(-/-) ont été étudiées. Ces souris ne sont pas obèses et n'ont présenté aucun défaut de thermogenèse. Cependant, elles survivent à une infection par le toxoplasme contrairement aux souris contrôles. Ces résultats mettent en évidence un rôle relativement inattendu d'UCP2 dans la réponse immunitaire. Un rôle d'UCP2 associé à une production de ROS a ensuite été montré.

The mitochondrial uncoupling protein UCP2 is widely expressed in various tissues. The analysis of variations of the mRNA level in different physiological situations suggested a transcriptional regulation of the Ucp2 gene. The cloning and sequencing of the human gene showed a GC rich promoter. Transfections of CAT-constructs in an adpocyte cell line showed a strong promoter activity. An ORFl, non-related tu UCP2, was detected in the exon 2. Nevertheless, the translation of UCP2 protein was not altered by the presence of the upstream ORFl in reticulocyte lysate. In order to study further the regulation of UCP2 protein synthesis in vivo reliable antibodies had to be generated. Characterization of anti-UCP2 antibodies commercially available showed that ail antibodies detected UCP2 when expressed in heterologous system, but not in vivo. Those antibodies revealed a pattern of proteins from control mice mitochondria that was identical to the one from Ucp2-deficient mice mitochondria. Expression of the whole UCP2 protein in Escherichia coli followed by its purification was carried out. The purified protein was injected into rabbits, antibodies were obtained and were purified with by affinity chromatography. One antiserum was highly sensitive and detected UCP2 in spleen, lung, stomach and white adipose tissue whereas no band was observed in tissues mitochondria from Ucp2-deficient mice. Expression of UCP2 protein was studied on mitochondria from starved mice or mice injected with LPS, physiological situations known to trigger an oxidative stress. Increased of UCP2 protein level, not associated with variation of the mRNA level, was observed in stomach and Jung. A marked translational regulation was shown linked to the presence or the absence of the upstream ORF1. In other experiments, Ucp2-deficient mice were studied. These mice exhibit neither thermogenesis defect nor obesity phenotype but are completely resistant to infection with Toxoplasma Gondii, in contrast to the wild-type littermate which survive. Further analysis revealed that the absence of UCP2 increase the production of reactive oxygen species (ROS) in macrophage which confirm the hypothesis that a mild mitochondrial uncoupling prevent the production of ROS.