Etudes de structures formées par des oligonucléotides fonctionnalisés et de leur interaction avec l'intégrase du VIH-1 : )

par Priscille Brodin

Thèse de doctorat en Pharmacochimie moléculaire

Sous la direction de Christian Auclair.

Soutenue en 2000

à Paris 11 .

Le président du jury était Roger Monier.

Le jury était composé de Roger Monier, Marc Fontecave, Simon Litvak, Michel Duguet, Jean-François Mouscadet.

Les rapporteurs étaient Marc Fontecave, Simon Litvak.


  • Résumé

    L'impossibilité d'éradiquer complètement le virusVIH-1 d'un organisme infecté et l'apparition de mutants résistants aux multithérapies nous conduit à poursuivre les recherches de drogues actives. Dans ce contexte, l'intégration de l'ADN du Virus de l'Irnmunodéficiënce Humaine de type 1 (VIH-1) dans le génome des cellules hôtes se présente comme une cible pharmacologique privilégiée. Cette étape est catalysée par l'intégrase (IN), une enzyme virale qui se fixe aux extrémités de l'ADN viral et réalise son insertion dans le génome de la cellule hôte. L'objectif de ce travail consiste à caractériser les interactions entre l'intégrase et des oligonucléotides fonctionnalisés inhibiteurs de l'intégration in vitro. Dans l'optique du ciblage des extrémités de l'ADN viral par des oligonucléotides formant des triples hélices (OFT), nous avons réalisé une étude fondamentale sur la formation de triple hélice alternée afin d'optimiser la séquence de l'oligonucléotide troisième brin au niveau du saut de brins. Dans ce but, la séquence modèle étudiée est un duplex composé de deux longs blocs homopurine-homopyrimidine séparés par une jonction ApT analogue à celle présente sur l'extrémité LTR U5 de l'ADN viral. Nous montrons que l'addition d'un résidu adénine et la suppression d'un nucléotide sur l'oligonucléotide troisième brin (OFT) favorisent le saut de brins aux jonctions 5 '-TpA-3' et 5 '-ApT-3' respectivement. Ces résultats proposent un 'code moléculaire du saut de brins' pour la conception d'oligonucléotides formant des triples hélices alternées et offrent de nouvelles possibilités pour l'extension du champ d'application de la stratégie antigène. En parallèle, différents oligonucléotides-intercalants 11-mer composés de (G,A) ou de (G,T,A) se sont révélés être de bons inhibiteurs de l 'intégrase in vitro. En particulier, un oligonucléotide 5'-5 ' (G,A) et couplé à l'intercalant oxazolopyridocarbazole (OPC) à chacune de ses extrémités adopte une autostructure de type duplex parallèle et inhibe l'intégrase de façon spécifique. L'effet inhibiteur de ce conjugué apparaît en étroite corrélation avec son autostructuration. Ces résultats offrent de nouvelles hypothèses quant au mode de reconnaissance d'ADN ayant une structure particulière par l'intégrase. Enfin, nous montrons que des oligonucléotides courts contenant une base modifiée, la 6- oxocytosine, possèdent des propriétés inhibitrices de l'intégrase particulièrement originales. Ces composés s'avèrent être des inhibiteurs compétitifs empêchant la fixation de l'intégrase sur son substrat et apparaissant capables de dissocier le complexe IN-ADN viral. Ces résultats suggèrent que ces oligonucléotides contenant des bases modifiées pourraient agir directement sur les complexes de préintégration.


  • Résumé

    Integration of a DNA copy of HIV-1 genome into chromosomal DNA of infected cells is a key step of viral replication and maintenance of persistent infection. Integration is carried out by integrase (IN), a viral protein that binds to both ends of viral DNA and catalyses reactions of 3'-end processing and strand transfer. Two viral factors are essential for integration: the viral DNA termini (called U5 LTR and U3 LTR ends) and IN. The present study focuses on the development of functionalized oligonucleotides as anti-IN drugs. First, the U5 LTR end contains two adjacent purine tracts on opposite strands separated by a ApT junction, which could be targeted by alternate-strand triple helix forming oligonucleotides (TFO). To achieve this, we optimized triple helix formation at the 5'-TpA-3' and at the 5'-ApT-3' junction steps on a sequence appropriately designed with two adjacent alternate-strand polypurine tracts. Footprint experiments, gel retardation assays and thermal denaturation measures point out that the addition of a adenine residue and the removal of one nucleotide should facilitate the crossing strands at the 5'-TpA-3' junction and at the 5'-ApT-3' junction, respectively. These results provide a 'switch code' for the construction of alternate-strand triple helix forming oligonucleotides, which open new possibilities for extending the range of application of antigene strategy. Second, a 3'-3' branched oligonucleotide functionalised by the intercalator oxazolopyridocarbazole at each 5'-end was found to inhibit integration in vitro. We show that both a specifie (G, A) sequence and the OPC intercalating agent contribute to the capability of the branched oligonucleotide to form a parallel stranded structure responsible for the inhibition. Third, we report that a short 11-mer 6-oxocyditine modified oligodeoxynucleotide prevent the binding of integrase to viral LTR ends both before and after that integrase-viral DNA complexes are being preformed. The described inhibitory effect on substrate binding correlates strongly with the inhibition of both catalytic activities of integrase in vitro by this conjugate. These findings may lead to new insights into the search of new inhibitors of preintegration complexes.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (207 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. p. 185-206 (316 réf.)

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  • Cote : TD/2000T015
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  • Cote : MFTH 951

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