Formation et stabilité des triples hélices purines : études in vitro et dans les cellules de mammifères

• Auteur / Autrice : Arnaud Debin
• Direction : Claude Malvy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie moléculaire
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 11
• Jury : Président / Présidente : Claude Hélène
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claude Hélène, Eliane Taillandier, Carine Giovannangeli, Fédor Svinartchouk, Annick Harel-Bellan
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Eliane Taillandier, Carine Giovannangeli

Mots clés

Mots clés contrôlés

Paraquat

Stabilité

Purines

Oligonucléotides

Triple-hélice

Génétique animale

Résumé

Les oligonucléotides qui forment des triples hélices (OFT) sont de courts fragments d'acides nucléiques capables de reconnaître sélectivement des séquences d 'ADN double brins. Dans ce travail, nous avons étudié la formation et la stabilité de triples hélices obtenues à l'aide d'oligonucléotides composés de purines, les OFT (G,A). Nous avons sélectionné in vitro les séquences d'ADN double brin capable de former des triples hélices stables à 20°C et 50°C dans des conditions ioniques déterminées. Cette sélection a été obtenue par une double approche aptamère dans laquelle les séquences de départ des oligonucléotides et les duplex cibles d 'ADN sont aléatoires. Les séquences sélectionnées obéissent à 2 règles : - elles possèdent toutes un grand pourcentage de guanine: elles sont dites riches en G - pour un nombre de G donné, la stabilité du triplex résultant est plus grande si les guanines se suivent en bloc non interrompu par des adénines. Cette étude démontre l 'importance cruciale de la composition relative en guanine de l'OFT sur la stabilité de la triple hélice. Elle conduit à la notion de triples hélices riches en G, qui englobe les triples hélices purines G,A mais aussi les triples hélices mixtes G,T. L'étude de la formation et de la stabilité des triples hélices riches en guanine in vitro, dans des conditions ioniques mimant les conditions ioniques intracellulaires, a confirmé la grande sensibilité des triples hélices purines aux concentrations en magnésium mais aussi au potassium, notamment sur la cinétique de formation, limitant potentiellement leur utilisation en culture cellulaire. Afin de surmonter l'effet inhibiteur du potassium, un nouveau concept d'oligonucléotide OFT, que nous appelons le concept '' oligonucléotide ZIPPER'', a été développé. Nous avons ensuite étudié la stabilité et la formation des triples hélices purines ex vivo, grâce à l'utilisation d'une technique d 'empreinte au Diméthylsulfate (DMS), permettant la visualisation de l'empreinte de 1'oligonucléotide sur l'ADN directement dans les cellules. Ceci a permis de démontrer la stabilité des triples hélices dans les cellules de mammifères lorsqu'elles sont introduites artificiellement dans les cellules après préformation in vitro. En revanche, nous n’avons pu détecter par cette méthode la formation des triples hélices directement dans les cellules.

Triplex-Forming Oligonucleotides (TFOs) are short nucleic acid fragments able to recognize selectively double-stranded DNA sequences. In this thesis, we have studied the formation and stability of triples helices using purine TFOs (composed of Guanines and Adenines). Firstly, we have selected double-stranded DNA sequences capable offorming stable triplexes at 20 or 5. Q. °C with corresponding 13mer purine oligonucleotides. This selection was obtained by a double aptamer approach where both the starting sequences of the oligonucleotides and the target DNA duplex were random. The results of selection were confirmed by a cold exchange method and the influence ofthe position of a 'mismatch' on the stability ofthe triplex was documented in several cases. The selected sequences obey two rules: (i) they have a high G content; (ii) for a given G content the stability of the resulting triplex is higher if the G residues lie in stretches. Secondly, triplex formation was studied in conditions mimicking potassium concentrations and temperatures in cells. In presence of 1OmM Mgcl2, KCl concentrations up to 150 mM significantly lowered both efficiency (triplex: initial duplex) and rate constants of triplex formation. For 20 mer TFO, no dissociation of triplex was observed during 24 hours either in the absence of monovalent cations or in the presence of 150 mM KCl. In this case, the negative effect of the KCl is probably due to the self-association of the oligonucleotide in competitive structures. This negative effect may be overcome by the prior formation of a short duplex either on the 3 '-or 5'- end of the 20mer TFO. We refer to these partial duplexes as 'zipper' TFOs. It was demonstrated that a 'zipper' TFO could forma triplex over the full lengh of the target, thus unzipping the short complementary strand. Thirdly, triplex stability and formation was studied in live mammalian cells. Ex vivo DMS footprint analysis after electroporation of the pre-formed into the cell have shown the presence of the triple helix inside the cells. However we were unable to show triplex formation inside cells using various methods of oligonucleotide delivery, and using various target sequences. Our results show that neither (i) chromatinization of the DNA target, (ii) intracellular K+ concentration nor (iii) cytoplasmic versus nuclear separation of the TFO and DNA target are responsible for the intracellular arrest of triplex formation. We suggest the existence of a cellular mechanism, based on a compartmentalization of TFOs and/or TFO trapping, which separates oligonucleotides from the DNA target. Further work is needed to find oligonucleotide derivatives and means for their delivery to overcome the problem of triplex formation inside cells.