Effet du rayonnement ionisant sur l'ADN cellulaire : Mesure des bases puriques et pyrimidiques modifiées

• Auteur / Autrice : Jean-Pierre Pouget
• Direction : Jean Cadet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Radiobiologie
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 11
• Jury : Président / Présidente : Jean-Marc Cosset
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Marc Cosset, Evelyne Sage, Pascal Gauduchon, Monique Gardès-Albert, Jean-Luc Ravanat
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Evelyne Sage, Pascal Gauduchon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Médecine nucléaire

Chromatographie par échange d'ions

Oxydation

Ions lourds

Rayons gamma

Test des comètes

Chromatographie

Spectrométrie de masse

ADN recombiné

ADN -- Réparation

Mots clés libres

8-Oxoguanine

Diols de thymidine

Résumé

Nous avons mesuré plusieurs modifications de bases dans l'ADN de monocytes, exposés au rayonnement y du 60Co, à la lumière UV LASER de haute intensité, ou soumis à un flux de particules de 12C6+. Nous avons eu recours à deux approches complémentaires. La première a impliqué les méthodes de chromatographie liquide haute performance ou gazeuse couplées à une détection par spectrométrie de masse (CLHP-SM/SM ou CG-SM) ou par électrochimie (CLHP-DE). Ces différentes techniques ont permis la mesure du niveau basal et du taux de formation de 7 lésions. La deuxième approche était basée sur l'utilisation de la méthode des comètes associée aux enzymes de réparation Fpg et endo III. La méthode, sous sa forme standard, permet de mettre en évidence les cassures simple et double brin ainsi que les sites alcali-labiles de l'ADN. Associée à Fpg et endo III, elle a permis de quantifier respectivement des purines et des pyrimidines modifiées. La confrontation des deux approches et le recours à d'autres agents oxydants comme le rayonnement UVA ou des photosensibilisateurs exogènes, a permis de calibrer la méthode afin d’estimer le niveau des différentes classes de lésions. Il ressort de ces travaux que l'approche indirecte, bien que moins spécifique est moins sujette aux problèmes d'oxydation des bases normales rencontrés lors de la préparation et de l'analyse des échantillons par les méthodes chromatographiques d 'analyse. Toutefois, lorsque ces problèmes d'oxydation sont pris en considération dans les mesures analytiques, les deux approches donnent approximativement les mêmes valeurs. Dans le cas contraire, des variations d 'un facteur 100 à 1000 peuvent être observées. Ainsi, il apparaît aujourd'hui que la plupart des travaux antérieurs concernant la mesure des bases modifiées de l'ADN par la méthode CG-SM doivent être reconsidérés.

The main objective of the current project was to measure DNA base damage in the DNA of a monocytic cell line exposed to y-ray,UV LASER pulses orto 12C6+ particles. For this purpose, two approaches were developed. The first one consisted of chromatographie methods including high performance liquid or gas chromatography assay coupled with either an electrochemical (HPLC-EC) or a mass spectrometry detection (HPLC-MS/MS, GC-MS). After optimisation, the latter methods allowed the measurement of the level of 7 base lesions. An indirect approach based on the cornet assay associated to DNA N-glycosylases was also applied. The latter method, under its standard form, allowed the detection of single and double strand breaks together with alkali-labile sites. Associated to DNA repair enzymes such as Fpg and endo III, it allowed the measurement of modified purines and pyrimidines, respectively. Lt was possible to calibrate the modified cornet assay in order to evaluate the level of the previous classes of lesions. For this purpose, cells were also exposed to UVA and exogenous photosensitisers. Although the cornet assay associated to Fpg and endo III can suffer from a lack of specificity, it was shown to be less subject to the artefactual oxidation ofthe normal bases which occurs during the preparation of the samples prior to their analysis by HPLC-EC or GC-MS. However, when much attention is devoted to reduce these drawbacks, indirect and direct approaches give approximately the same values. These levels are at least 100 fold lower than those reported by many previous studies involving the use of GC-MS assay. Therefore, many results inferred from the latter method have today to be reconsidered.