Selection in vitro de ribozymes allosteriques pour le controle de l'expression des genes

• Auteur / Autrice : NICOLAS PIGANEAU
• Direction : Michael Famulok
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Nous cherchons a developper un systeme de controle de l'expression genique ayant les proprietes suivantes : pas de co-expression de facteurs proteiques de controle, usage d'une molecule regulatrice non toxique et activation de l'expression en presence de la drogue. La selection in vitro est un outil permettant l'isolation d'acides nucleiques extremement rares. Nous avons imagine tirer parti de cette methode pour isoler des arn catalytiques (ribozymes) regulables par une drogue arbitrairement choisie (doxycycline ou pefloxacine). Inseres dans un arn messager (arnm), un tel ribozyme devrait inhibiber l'expression du gene en se clivant, provoquant la degradation du transcrit. L'administration de la molecule regulatrice devrait empecher le clivage et permettre une restauration de l'expression. Nous avons introduit dans la sequence du ribozyme a tete de marteau un segment aleatoire, et soumis la bibliotheque ainsi formee a une selection fonctionnelle. Apres 16 cycles de selection de plus en plus stringente, nous avons pu observer des clones repondant a des quantites tres faibles de la drogue regulatrice (20 nm). De plus certains clones sont tres selectifs pour leur ligand. Dans certains cas, ils sont 10 000 fois plus sensibles pour la doxycycline que pour la tetracycline bien que ces deux molecules ne different que par la position d'un groupe hydroxyle. L'introduction d'une mutation ponctuelle permet la conversion des ribozymes en aptameres classiques. Dans un cas, la determination d'un motif de liaison minimum a permis l'elaboration d'hypotheses quant au mecanisme d'inhibition. Par contre, l'introduction des ribozymes selectionnes dans un arnm n'a pas permis d'observer l'effet voulu. Pour un clone, la drogue a induit une inhibition de l'expression du gene rapporteur d'un facteur 2, ce qui correspond a l'effet inverse a l'effet attendu. Ce resultat laisse envisager que la cause n'est pas perdue et suggeste des experiences visant a l'isolement de sequences ayant l'activite appropriee. Ce travail a permis la decouverte de ribozymes allosteriques plus de mille fois plus sensible a la molecule regulatrice par rapport aux resultats publies anterieurement. De plus, la possibilite de convertir en aptameres les clones selectionnes invite a imaginer un role plus large pour ce type de selection fonctionnelle.