Nouveaux peptides antibiotiques de champignons trichoderma biosynthèses dirigées isolement, purification et caractérisation de la peptaibol-synthétase de T. Longibrachiatum

• Auteur / Autrice : Grégory Leclerc
• Direction : Sylvie Rebuffat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées. Sciences médicales
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biosynthèse

Peptaïbols

Résumé

Les champignons microscopiques du genre trichoderma biosynthétisent des peptides antibiotiques actifs contre les bactéries a gram positif et les mycoplasmes, la cible étant la membrane plasmique. Ces peptides linéaires hydrophobes, nommes peptaibols, sont riches en acide alpha-aminoisobutyrique (AIB), bloques par un acétyle n-terminal et un amino alcool c-terminal. Ils résultent d'une voie de biosynthèse non ribosomale utilisant des protéines multifonctionnelles, les peptide-synthétases. Nous avons étudié deus souches : I)- T. Longibrachiatum qui produit des peptaibols de 20 résidus, les longibrachines LGA (GLN 1 8), II)- T. Harzianum qui conduit à des peptaibols neutres de 18 résidus (trichorzines PA) et 14 résidus (harzianines pc). Par RMN et modélisation moléculaire, nous avons montre que la structure tridimensionnelle de la longibrachine LGA i est une hélice droite mixte (alpha/3 1 0), présentant dans la région 10-13 un coude du a la proline 14. Ces hélices amphipathiques sont connues pour s'associer dans les bicouches phospholipidiques. La biosynthèse dirigée in vivo par apport exogène d'acides amines (aib, arg, glu) au milieu standard de culture conduit, pour les deux souches, a la simplification des mélanges peptidiques. T. Harzianum fournit ainsi quatre nouveaux peptaibols, dont les séquences ont été déterminées par spectrométrie de masse. La peptide-synthétase de T. Longibrachiatum a été purifiée en cinq étapes. Pour suivre l'activité enzymatique, nous avons mis au point deux tests reposant sur des mesures de radioactivité, l'échange atp- 3 2pppi et la formation d'un thioester avec la valine tritiee. La longibrachine-synthétase est caractérisée par un point isoélectrique de 5,5 et une masse moléculaire de 1920 KDA déterminée par ultracentrifugation (sédimentation a l'équilibre). Cette enzyme est ainsi la peptide-synthétase de plus haute masse moléculaire isolée et caractérisée jusqu'a présent.