Transfert de gene par un vecteur non viral compose d'une sequence de ciblage des integrines et d'un liposome cationique : efficacite et devenir intracellulaire

• Auteur / Autrice : Morvane Colin
• Direction : MARIE-CHRISTIANE BRAHIMI HORN
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

Un des buts de la therapie genique est d'introduire dans une cellule un gene-medicament afin de corriger un dysfonctionnement de son programme genetique. Cette nouvelle therapeutique necessite, la plupart du temps, la mise au point d'une vectorisation afin de transporter ce gene-medicament dans la cellule. Nous avons ainsi montre, dans un modele de cellules tracheales humaines, une augmentation specifique d'un facteur 10 de l'expression d'un plasmide (adnp) codant pour le gene rapporteur luciferase lorsque celui-ci est condense par un peptide cyclique specifique des integrines, comprenant une sequence polylysine-arg-gly-asp (k 1 6rgd). L'addition d'un lipide cationique au complexe adnp:k 1 6rgd permet d'obtenir des niveaux d'expression comparables a ceux obtenus avec un adenovirus, en ameliorant l'efficacite du vecteur d'un facteur 30. Ce lipopolyplexe (adnp:k 1 6rgd : lipide) penetre dans la cellule par endocytose mediee par les integrines, impliquant les puits recouverts de clathrine. L'augmentation de l'expression du gene rapporteur luciferase, en presence du lipide, est correlee avec une augmentation du passage de l'adnp dans les endosomes/lysosomes, une diminution de l'exocytose de l'adnp et un meilleur transfert nucleaire. Le trafic intracellulaire necessite une fusion endosomale et un environnement vesiculaire acide est benefique a l'efficacite du vecteur lipidique. Le passage de l'adnp a travers l'enveloppe nucleaire serait un mecanisme actif impliquant les pores nucleaires et ne necessitant pas l'apport d'elements cytosoliques. Le lipopolyplexe peut transfecter des cellules quiescentes mais son activite est multipliee par quatre sur des cellules en mitose. Des etudes in vivo chez la souris nous ont permis d'etablir que l'hemoglobine masquait la detection de l'activite luciferase. Une perfusion appropriee des organes permettant d'extraire l'hemoglobine s'impose alors, afin de determiner l'expression in vivo du gene rapporteur luciferase. Ces travaux participent a l'amelioration des connaissances devant permettre a terme, une optimisation des vecteurs non viraux necessaire a l'obtention d'essais cliniques concluants.