Activité antisens d'oligonucléotides phosphodiesters véhiculés par un polymère cationique

• Auteur / Autrice : Sonia Dheur
• Direction : Tula Saison-Behmoaras
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Paris, Muséum national d'histoire naturelle
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la nature et de l'Homme - Évolution et écologie (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Claude Hélène
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascale Briand, Jean-Paul Behr, Tula Saison-Behmoaras
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Annie-Claude Roche, Daniel Scherman

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN messagers

Nucléases

Acides nucléiques antisens

Résumé

Des critères de stabilité des oligonucleotides établis in vitro en présence de nucléases d'origines diverses ont conduit a l'élimination des oligonucleotides phosphodiesters des applications antisens. Pourtant, ces molécules cumulent tous les avantages d'un point de vue facilite de synthèse, cout, toxicité et biodégradation. Nous avons donc étudie de plus prés la possibilité d'utiliser des oligonucleotides phosphodiesters proteges en 3 (pop) dans des cellules en culture, comme agents antisens diriges contre un transcrit endogène. Afin d'augmenter la pénétration intracellulaire de ces molécules, nous les avons transfectées à l'aide d'un polymère cationique, la polyethylenimine (pei). Nous avons observe que cette combinaison pop/pei induisait une diminution spécifique et sélective du niveau de l'arnm ha-ras cible, diminution équivalente a celle d'un oligonucleotide phosphorothioate (ps) véhicule par un lipide cationique, la lipofectin, et ce pendant 6 heures. Cependant, beaucoup de proteines ont une durée de vie allant au-delà de 24 heures. Dans l'hypothèse ou la perte d'activité des oligonucleotides pop est due au temps de vie limitée de l'oligonucleotide libre dans la cellule, nous avons ajoute une autre modification a cet oligonucleotide afin de prolonger cette activité antisens. La modification 2-o-methyl stabilisant vis-à-vis des nucléases, nous l'avons ajoutée aux extrémités de l'oligonucleotide pop en conservant une fenetre centrale non-modifiée afin d'induire la coupure de l'arn cible par la rnase h. Nous avons observe dans un premier temps que ces oligonucleotides fenêtre induisaient une diminution du niveau de l'arnm ha-ras équivalente a celle d'un oligonucleotide pop, 4 heures après electroporation. Une étude cinétique de l'activité antisens de cet oligonucleotide fenêtre, transfecte en présence d'un transporteur adéquat, nous révélera s'il est possible d'obtenir une activité antisens prolongée avec un oligonucleotide phosphodiester. Alors que notre génome est séquence, nous allons avoir besoin d'outils de biologie moléculaire pour étudier la fonction de gènes en invalidant spécifiquement leur expression. Dans ce contexte, les oligonucleotides antisens phosphodiesters pourraient être des outils intéressants a condition de pouvoir prolonger leur activité. Nous avons montre que la pei permettait d'introduire ces molécules dans les cellules de manière très efficace. Cependant, une grande partie des oligonucleotides internalises semble être séquestrée. Une étude approfondie du rôle des transporteurs dans le devenir intracellulaire des oligonucleotides devrait permettre d'augmenter la réactivité de ces molécules afin d'optimiser leur utilisation en tant qu'outils de biologie moléculaire.