Étude d'un complexe anticorps - haptène : détermination et modification par ingénierie génétique des éléments moléculaires impliqués dans cette interaction

• Auteur / Autrice : Florence Viola-Bettsworth
• Direction : Michel Jolivet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences
• Date : Soutenance en 2000
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Jolivet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Haptènes

Mutagenèse

Sites actifs (biochimie)

Anticorps monoclonaux

Estradiol

Complexes immuns

Résumé

Le travail présenté dans ce rapport s'inscrit dans un projet d'ingénierie génétique et moléculaire qui a pour but l'amélioration de la sensibilité d'anticorps monoclonaux anti-œstradiol vis-à-vis de l'œstradiol naturel. En effet, obtenir des anticorps anti-stéroi͏̈des spécifiques et très affins est difficile en raison de la petite taille des molécules et des réactions croisées avec des analogues de structures très proche. À partir des hybridomes d'anticorps monoclonaux anti-œstradiol très spécifiques, les techniques de l'ADN recombinant nous ont permis d'isoler et amplifier les gènes codant la chaîne légère et la région Fd et d'en déterminer leur séquence nucléotidique. Les gènes codant les régions variables ont été assemblés en scFv (''single chain Fragment variable''), clonés et exprimés sous forme de protéines recombinantes. Les scFv ont été testés pour évaluer leur capacité à reconnaître l'œstradiol. Nous avons ensuite cartographié le paratope fonctionnel de l'anticorps 17E12E5, par une approche combinant modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée. Les résultats ont été confirmés et complétés par la résolution de la structure tridimensionnelle du complexe à partir de cristaux de fragments de l'anticorps avec l'œstradiol naturel. À partir de ces différentes informations structurales et fonctionnelles, deux banques de variants du scFv 17E12e5 ont été construites. Ces banques ont été exprimées puis criblées via la technique de ''phage display''. Enfin, les variants isolés à l'issue de la sélection ont été caractérisés.