Lésions tandem radio-induites de l'ADN : formation, insertion dans des oligonucléotides et réparation

par Anne-Gaëlle Bourdat

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Jean Cadet.

Soutenue en 2000

à Grenoble 1 .


  • Résumé

    La formation de lesions simples de l'adn generees par des photosensibilisateurs excites, les radiations ionisantes, les agents chimiques ne peut expliquer a elle seule la forte letalite cellulaire. Aussi, des modifications multiples sont supposees avoir un fort impact biologique. Parmi ces lesions complexes, la n-(2-desoxy, d-erythro-pentofuranosyl)-formylamine (df)/8-oxo-7,8-dihydro-2-desoxyguanosine (8-oxodguo) a ete observee dans de courts fragments d'adn apres exposition a un rayonnement x en solution aqueuse aeree. Afin d'evaluer les consequences biologiques liees a la presence de telles lesions, les residus 8-oxodguo et df ont ete introduits dans des oligonucleotides synthetiques en position vicinale. La chimie des phosphoramidites pac sur support solide a permis de preparer les oligonucleotides modifies. La purete des fragments d'adn synthetiques et l'integrite des bases modifiees inserees ont ete confirmees par differentes techniques analytiques : clhp, page, sm ies, sm malditof et electrophorese capillaire. Ces modeles synthetiques ont ete utilises pour determiner les specificites de substrats et les mecanismes d'excision de trois adn n-glycosylases impliquees dans la reparation par excision de base : endo iii et fpg of e. Coli ainsi que yogg1 of s. Cerevisiae. Les oligonucleotides sont incises par chacune des trois enzymes etudiees. Pourtant, les lesions tandem ne sont pas completement excisees par ces enzymes. L'efficacite d'excision, determinee par le rapport des constantes cinetiques de michaelis vm/km, n'est que peu modifiee par la presence des dommages multiples. La sm maldi-tof apporte des informations interessantes quand au mecanisme d'action des enzymes. Des experiences de replication in vitro ont montre que la progression des trois polymerases taq pol, pol et le fragment de klenow exo, est arretee par la presence des lesions tandem. Enfin, nous avons mesure par lc-ms/ms le taux de lesion tandem genere dans de l'adn expose a un rayonnement. Les lesions df-8-oxodguo et 8-oxodguo-df se forme significativement dans ces conditions. Il est interessant de noter que le dommage 8-oxodguo-df est produit en plus grande quantite que la lesion de sequence inverse. De plus, les resultats de ces experiences indiquent indirectement qu'il se forme d'autres dommages multiples comportant une lesion 8-oxodguo.


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