Mecanisme de transfert de l'adn viral a travers les membranes. Etudes in vitro des interactions entre proteines virales, adn, et recepteur bacterien

• Auteur / Autrice : LAURE PLANCON
• Direction : LUCIENNE LETELLIER
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

De nombreuses proteines de la membrane externe d'e. Coli ont ete detournees de leur fonction physiologique par des phages qui s'en servent comme recepteur pour s'ancrer a la surface de la bacterie. L'une d'entre elle, fhua, est le recepteur du bacteriophage t5. Sa fonction physiologique est de transporter le fer couple a un siderophore (le ferrichrome). L'objet de cette these est l'etude d'une etape precoce de l'infection phagique : la fixation du phage sur le recepteur, et le transport de l'adn viral a travers l'enveloppe bacterienne. Pour etudier cette etape, nous avons mis au point un systeme permettant l'etude in vitro du transfert d'adn viral a travers une membrane. Pour cela, la proteine fhua a ete reconstituee dans des liposomes. La morphologie et la fonctionnalite du systeme ont ete caracterises. La proteine reconstituee provoque l'ejection de l'adn du phage t5 ; elle est aussi capable d'adopter une conformation en canal ouvert lors de son interaction avec le phage t5. Nous avons mis en evidence par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de cryomicroscopie electronique la presence d'adn dans l'espace interne des proteoliposomes. Ceci nous a permis de demontrer que le transport de l'adn viral de t5 a travers une membrane est un processus impliquant le phage t5 et la proteine fhua independamment de tout autre composant bacterien. Nous avons egalement mene des etudes in vitro de la proteine phagique de liaison au recepteur fhua, pb5. Nous avons mis au point un systeme de surexpression de la proteine pb5 recombinante portant une etiquette histidine. Cette proteine a ete purifiee a grande echelle par chromatographie d'affinite. Sa fonctionnalite a ete demontree par des experiences de competition entre le phage et la proteine pb5 isolee pour la fixation de fhua en solution. Nous avons par ailleurs entrepris la caracterisation, de pb5 et du complexe forme par ces deux proteines. L'ensemble des donnees nous ont permis de proposer de facon preliminaire une stchiometrie du complexe : deux proteines fhua pour une proteine pb5. L'ensemble de ces etudes devrait permettre une meilleure comprehension du mecanisme de transport de l'adn viral, mais aussi des mecanismes moleculaires de transport a travers fhua.