Etude physico-chimique et biologique de l'association d'un oligonucleotide avec un arn simple brin ou un adn double brin

• Auteur / Autrice : HERVE GOUSSET
• Direction : Eliane Taillandier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Paris 7

Résumé

Deux strategies utilisant des oligonucleotides synthetiques ont ete elaborees pour controler selectivement l'expression de genes impliques dans certaines pathologies. L' oligonucleotide antisens cible l'arn messager du gene a inhiber et bloque son expression au niveau de la traduction. L'oligonucleotide formant une triple helice cible une sequence du gene au niveau de l'adn genomique en double brin et peut empecher sa transcription en arn messager. Dans la premiere partie de ce memoire, des oligonucleotides susceptibles de former en solution des triples helices intramoleculaires ont ete utilises. Par spectroscopies uv et irtf, deux triples helices composees uniquement de triples t. A*a, dans lesquelles les deux brins composes d'adenines sont paralleles ou antiparalleles, ont ete etudiees. Par ailleurs, la formation de deux triplets helices intramoleculaires composees de triplets c. G*g et t. A*t dans lesquelles le duplex watson-crick est identique et le troisieme brin est parallele ou antiparallele, a ete prouvee par gel d'electrophorese, digestion enzymatique par la nuclease s1, spectroscopie (uv et cd). Des informations sur l'appariement du troisieme brin ont ete obtenues par modification moleculaire en presence de sondes chimiques (kmno 4 et dms). L'implication des oligonucleotides synthetiques dans les strategies antisens et triple helice est ensuite abordee. L'etude par spectroscopie irtf de la structure d'une double helice hybride adn*. Arn dans laquelle le brin adn* est chimiquement modifie en vue d'une utilisation en strategie antisens a permis de montrer que les modifications envisagees permettent de pre-organiser l'antisens dans une geometrie favorisant son association avec le brin arn. La formation de la triple helice composee d'un oligonucleotide et d'une sequence du promoteur de l'oncogene humain her-2(neu) a ete prouvee par spectroscopie irtf et electrophorese sur gel non denaturant. Des tests realises ex vivo sur des cellules en culture ont montre une inhibition partielle et temporaire de l'expression de l'oncogene. L'oligonucleotide utilise est susceptible de former d'autres structures entrant en competition avec la formation de la triple helice. Deux types d'association ont pu etre reveles sur gel d'electrophorese. Dans la derniere partie de ce memoire, nous nous sommes interesses au role important des molecules d'eau dans la structure des triples helices d'acide nucleique. Des mesures gravimetriques et des donnees structurales obtenues par spectroscopie irtf ont ete recueillies a differentes humidites relatives pour la triple helice dt n. Da n*dt n et le duplex correspondant dt n. Da n et pour les analogues ribonucleotidiques, la triple helice ru n. Ra n*ru n et le duplex correspondant ru n. Ra n. Des simulations par dynamique moleculaire ont permis d'interpreter les differences d'hydratation mesurees experimentalement a haute humidite relative entre la triple helice dt n. Da n*dt n et la double helice dt n. Da n.