Etude et caracterisation structurale de modifications post-traductionnelles de la tubuline par spectrometrie de masse : la polyglycylation et la polyglutamylation

• Auteur / Autrice : Joëlle Vinh
• Direction : Jean Rossier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques fondamentales et appliquées
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Paris 6

Résumé

La tubuline est un hetero-dimere compose de 2 sous unites alpha et beta. C'est l'unite constitutive des microtubules, qui interviennent notamment dans la motilite et la division cellulaire. Cette proteine possede un degre d'heterogeneite eleve, du en particulier a de nombreuses modifications post-traductionnelles. Deux d'entre elles lui sont specifiques : la polyglutamylation et la polyglycylation laterales. Elles consistent en l'addition de chaines polyglutamate ou polyglycine sur la fonction gamma-carboxylique de residus glutamate c-terminaux. Le sequencage des peptides modifies permet de determiner le nombre de sites modifies et le nombre de residus portes sur chacun de ces sites. Deux techniques de spectrometrie de masse ont ete employees : le maldi-tof et le nanoesi q-tof. La polyglycylation de la tubuline est le cas le plus simple. La glycylation, decouverte sur les microtubules stables des axonemes, se produit aussi dans le cytoplasme. Le peptide c-terminal de la proteine, de sequence 4 2 7dataeeegefeeegeq 4 4 2, peut porter jusqu'a 34 residus glycine lateraux. Une etude par degradation d'edman a montre que seuls les 4 derniers residus glutamate peuvent etre glycyles. Les niveaux de glycylation les plus eleves sont specifiques de la tubuline axonemale. L'optimisation de l'analyse en spectrometrie de masse a permis le sequencage rapide des peptides biologiques. Celui-ci montre que tous les sites potentiels de glycylation sont modifies. Un mecanisme enzymatique sequentiel pour cette modification peut etre propose. La polyglutamylation est plus delicate a etudier en raison de la fragmentation des chaines polyglutamate laterales pendant l'analyse. Nous avons mis au point une derivation de l'extremite n-terminale par addition d'un triphenylphosphonium et fixation d'une charge positive. La fragmentation des peptides polyglutamyles derives est beaucoup plus simple a interpreter. Ceci devrait permettre de generaliser notre approche a l'etude de la polyglutamylation.