Recherche Avancée

Thèse soutenue

Rôle de la structure quaternaire de la Glycéraldéhyde 3-phosphate Déshydrogénase (GAPDH) phosphorylante de Bacillus stearothermophilus dans la révélation de l'activité enzymatique et les propriétés de coopérativité de fixation du cofacteur

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Auteur / Autrice : Olivier Roitel
Direction : Guy Branlant
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Enzymologie moléculaire
Date : Soutenance en 1999
Etablissement(s) : Nancy 1
Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques

Résumé

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Notre étude a consisté à étudier les propriétés des GAPDH dimériques générées par ingénierie protéique, à les relier à leur état oligométrique et à les comparer à celles de l'enzyme tétramérique de type sauvage. A partir des structures cristallographiques des formes Apo- et holoenzyme de la GAPDH de B. Stearothermophilus connues à haute résolution et grâce à l'outil modélisation moléculaire, des mutations appropriées ont été introduites aux interfaces R et Q de la GAPDH tétramérique de type sauvage et ont permis de générer des GAPDH mutées produites sous forme strictement dimérique ou sous deux formes dimère et tétramère en équilibre. Notre étude a montré que les dimères générés sont très probablement de type O-P, en raison du plus grand nombre de contacts interatomiques s'établissant le long de l'interface P, du plus petit nombre de résidus hydrophobes exposés au solvant et de leur meilleure affinité pour le NADP comparée à celle pour le NAD. Les GAPDH dimériques générées sont inactives tandis que les formes tétramériques générées possèdent une activité enzymatique variable suivant les cas. Cette absence d'activité peut-être attribuée à une modification de la conformation du site actif, comparée à celle dans le tétramère. La fixation du NAD par la GAPDH de type sauvage et les GAPDH tétramériques mutées peut être décrite par un modèle à au moins 2 constantes de dissociation, indiquant que ces enzymes sont en fait constituées de 2 dimères indépendants. Cela n'est pas en contradiction avec la structure cristallographique de la GAPDH de B. Stearothermophilus qui peut être décrite comme un dimère de dimères. Les GAPDH dimériques testées conservent des propriétés de coopérativité de fixation du cofacteur, ce qui indique que l'interface P est essentielle pour transmettre l'information structurale. L'étude de l'équilibre existant entre les formes dimérique et tétramérique du mutant (N180G-E276G) a montré une apparente non totale réversibilité de l'équilibre.